生物工程下游技术-第三章-微生物细胞破碎.pptVIP

第三章 微生物细胞破碎和包含体的复性 细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。 为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； ◆超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。 ◆该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 ◆超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 ◆一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易 破碎，对酵母菌的效果较差。 第三节 包含体的分离和蛋白质复性 外源蛋白在大肠杆菌中的积累 目标蛋白的复性 以包涵体形式表达蛋白的优势 ①富含目的产物，有利于后续的分离纯化； ②沉积于包涵体的目标产物不易被蛋白酶水解； ③对于对宿主细胞有毒害或杀伤作用的目的产物，以包涵体形式表达有利。 以包涵体形式表达目的蛋白的操作 如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。 基因工程包含体的纯化方法 几种常见的工艺路线（一） 几种常见的工艺路线（二） 几种常见的工艺路线（三） 本章思考题 细胞破碎方法的原理、特性和适用对象。 破碎技术与上、下游过程相结合提高破碎的机理。 基因工程包含体的纯化方法。 如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。 （1）表面活性剂 可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。 处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。 （2）EDTA螯合剂 能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。 （3）有机溶剂 （4）变性剂 ◆盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。 ◆变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。 * * * 巨噬细胞 * * * * 植物细胞 * * * * * * 酵母菌 * * * 革兰氏阳性细菌 * * * * * * 革兰氏阴性细菌 螯合剂 生物试剂 抗生素 酶 有机溶剂 清洁剂 变性剂 细胞类型 * 表示适用 不同细胞可采用的化学渗透处理方式 化学渗透法优点： ◆细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。 ◆对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 缺点： 通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。 ◆将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。 ◆此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。 6.其他方法 (1) X-press法 ◆将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。 ◆仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。 (2) 渗透压法（Osmotic pressure） ◆将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。 ◆适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。 (3) 反复冻结-融化法 ◆使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。 ◆气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25