植物细胞培养(plant cell culture).pptVIP

植物细胞培养(Plant cell culture) 及次生代谢产物生产 第一节 悬浮培养 一、愈伤组织的诱导 较好的松散性 较强的增殖能力和再生能力 选择适宜的植物外植体材料(幼胚等); 培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响(生长素2，4-D等); 愈伤组织培养阶段必须进行必要的选择和继代. 二、悬浮系的建立与继代培养 悬浮系的建立: 10ml/g,120r/m,25℃黑暗培养,3天更换培养基; 继代培养: 蔗糖梯度离心法和过滤法 一周(1:4)或两周(1:10)更换培养基 80r/m 二、悬浮系的建立与继代培养 成功的细胞悬浮培养体系 分散性良好,细胞团较小,一般在30-50个细胞以下; 均一性好,细胞形状和细胞团大小大致一致,悬浮系外观为大小均一的小颗粒,培养基清澈透亮,细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色; 细胞生长迅速,悬浮细胞的生长量一般2-3天甚至更短时间便可增加1倍. 三、悬浮细胞的生长动态 生长呈S形生长曲线 起始密度(x0):0.5x105-2.5x105 生长速率(p) p=(lnx-lnx0)/t 单位体积细胞重量 鲜重:按一定体积取样,经真空过滤后称重 干重:真空过滤后,在80℃条件下烘干细 胞至恒重 四、悬浮培养细胞的同步化 分选法 通过细胞体积大小分级,直接将处于相同周期的细胞进行分选,然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中. 梯度离心法 流式细胞仪 四、悬浮培养细胞的同步化 饥饿法 饥饿导致细胞分裂受阻,使细胞不能合成DNA,即不能进入S期;或细胞分裂不能进行,即不能进入M期. 抑制剂法(5-氟脱氧尿苷,羟基尿) 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞,使细胞滞留在DNA合成前期,当解除抑制后,即可获得处于同一细胞周期---G1期的同步化细胞. 四、悬浮培养细胞的同步化 低温处理 提高培养体系中细胞同步化的程度 第二节 单细胞培养 细胞平板培养(cell plating culture) 植板率:能长出细胞团的单细胞在接种单 细胞中所占的比例. 看护培养(nurse culture) 第二节 单细胞培养 微室培养(micro-chamber culture) 为了进行单细胞活体连续观察而建立的单细胞培养技术. 其它单细胞培养技术 第三节 植物细胞的规模培养 概述 研究和开发适宜于植物细胞生长和次生代谢产物生产的生物反应器 建立最佳的控制和调节系统 第三节 植物细胞的规模培养 培养的细胞在遗传上应是稳定的,以得到产量恒定的产物; 细胞生长及生物合成的速度快,在较短的时间内能得到较高产量的终产物; 代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解,最好能将其释放到培养基中. 植物细胞规模化培养体系的建立 种子细胞的选择 选择自然状态下产生天然产物的器官、组织为外植体. 高产种子细胞克隆: 诱变和压力筛选 种子细胞系的增殖与放大培养 获得大量的活跃生长的细胞群体 植物细胞规模化培养体系的建立 大规模培养体系的建立 成批培养(batch culture): 培养装置和操作简单 培养检测困难 植物细胞规模化培养体系的建立 连续培养(continuous culture) 在培养过程中,不断向反应器中以一定的流量添加新鲜培养基。 延长细胞培养周期,从而延长目的产物的积累时间,增加目的产物产量。 植物细胞规模化培养体系的建立 半连续培养(semi-continuous culture) 两步培养法 生长培养基 合成培养基 生物反应器类型及特点 具有适宜的氧传递,良好的流动性 和较低的剪切力 1.搅拌式生物反应器 2.气动式生物反应器 3.固定化生物反应器 第四节 培养细胞的次生代谢及产物积累 植物次生代谢产物的主要类型 1.酚类化合物 黄酮类:治疗心血管疾病和高血压的药物成分 醌类化合物:抗菌、 抗癌 简单酚类:抗毒素 植物次生代谢产物的主要类型 2.萜类化合物 单萜和倍半萜:挥发油和香料的主要成份; 青蒿素(倍半萜),紫杉醇(二萜生物碱) 3.含氮化合物 生物碱: 胺类: 4.其它:有机酸,多炔 培养条件下的植物细胞次生产