模块四 逆境胁迫对植物生理生化指标 .pptVIP

L/O/G/O 逆境胁迫对植物生理生化指标的影响 李忠光，2011.5.25 模块四 综 合 性 实 验 * 目 的 掌握逆境胁迫下一些植物生理指标的测定方法； 了解逆境胁迫下植物生理生化指标的变化以及逆境伤害和适应的原因。 * 流 程 图 玉米幼苗 盐胁迫 高温胁迫 干旱胁迫 重金属 胁迫 低温胁迫 发芽率 脯氨酸 （Pro） GSH/ASA 可溶性糖 H2O2 丙二醛 （MDA） 水涝胁迫 抗氧化酶 (POD) 呼吸速率 * 根据生物膜透性 根据呼吸作用 染料法 纸上荧光法：种皮的透性，十字花科 5%红墨水染色法 0.1%靛蓝、曙红等染色法 TTC法:作为H受体 BTB法：外界pH的变化 I2-KI染色法：松、衫科种子 实 验 原 理 I * 实 验 原 理 I * 实 验 原 理 I TTC Method Dye Method * 实 验 原 理 II 4260 nm * 实 验 原 理 III * 实 验 原 理 IV * 实 验 原 理 V * 实 验 原 理 VI POD PPO * 实 验 原 理 VII 对硫二硝基苯酸 * 实 验 原 理 VIII Cited from Plant Physiology, 2003, 131: 697-706 * 实 验 方 法 I 种子发芽率的测定：各取50粒吸胀的玉米种子或小麦种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验： 其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴 20 min） 另50个半粒进行曙红染色（室温染色10 min） 根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。 * 品种为晴3或鲁玉13的玉米种子或小麦种子（购于西山种子公司）→ 用0.1% HgCl2消毒10 min后 → 用蒸馏水漂洗干净 → 用蒸馏水于26℃下吸涨12 h → 播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm×16cm）中 → 于26℃下暗萌发60 h →计算发芽率（注意与前面结果比较） → 选取长势一致的玉米幼苗做干旱5天、高温、盐渍或低温下处理（去除较矮或较高的玉米幼苗）。 实 验 方 法 I * 呼吸作用的测定： 材料的准备：将预测量的材料称重后（0.5g）放入测量瓶。 测定方法：打开电源预热5 min→打开气泵开关→打开闭路开关→用碱石灰管分别连接面板上的“OUT”和“IN”， 主机的“OUT1”和“IN1”分别与测量瓶的“OUT1”和“IN1”相连→立即开始记时→测量1min的CO2增加量 计算：每分钟每克材料的CO2释放量（mL.g-1.min-1）。 实 验 方 法 II * Pro的提取：分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 3% SSA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。 测定：上清液各2 mL →分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮试剂→煮沸15 min→冷却后→5000 rpm离心10 min（若没沉淀可略此步骤） →分别测定A520 计算： Pro content = (mmol.g-1FW) 实 验 方 法 III * MDA提取：分别取0.1 g实验组和对照组→加入3 mL 10%TCA和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 10%TCA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。 测定：分别取上清液各2 mL →加入0.6%TBA（用10%TCA配制） 2 mL→煮沸12 min→冷却后→5000 rpm离心5 min （视沉淀有无）→分别测定OD450和OD532 计算： 实 验 方 法 IV * H2O2提取：分别取0.1 g实验组和对照组→加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，内含1mM HA)和少许石英砂→充分研磨→用2 mL PBS洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。 测定：分别取上清液各3 mL →加入0.1%Ti(SO4)2 [用20%(v/v) H2SO4配制] 1 mL→摇匀→ 5000 rpm离心10 min → OD410 计算： H2O2 content = (mmol.g-1FW) 实 验 方 法 V * L/O/G/O