红豆杉内生真菌发酵培养过程中的碳源优化.docVIP

红豆内生真菌发酵培养的碳源优化1绪论 1.1引言 肿瘤的治疗在很大程度上依赖于抗肿瘤药，抗肿瘤药物研究方兴未艾。紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol)从红豆杉树皮中分离提纯的抗肿瘤药，由于其具有良好的抗癌活性和独特的抗癌机理，因而被认为是抗癌药物的“明星”。自1992年以来，紫杉醇已在许多国家成为治疗卵巢癌和乳腺癌的重要药物]。由于紫杉醇的药源植物——红豆杉属植物生长缓慢，紫杉醇含量很低 (干重的0.015%)而现有的资源又有限，因而紫杉醇的供应一开始就受到人们的关注。多年来人们一直在寻找能替代直接从植物中提取紫杉醇的方法、]。紫杉醇的化学全合成虽已完成，但路线复杂，目前无商业价值紫杉醇的半合成在一定程度上为缓解紫杉醇的供求矛盾近年来分别从红豆杉属（Taxus）中的短叶红豆杉（T brevifolia Nutt.）、云南红豆杉（T. yunnanensis）、西藏红豆杉（T. wallichinana）等树皮中分离中得到能产生紫杉醇的内共生真菌，这无疑为解决紫杉醇药源危机提供了一种新的途径。1.2内共生真菌内共生真菌(endophytic fungus)是一大类未被充分认识的真菌它泛指那些生活在健康植株不引起任何病害症状的所有真菌。在整个真菌发展史上内共生真菌的研究历史并不长]。 1924年，Lewis首次报道禾本科植物叶片中存在内共生真菌，但此后的研究工作一直很少，直到近年，对于植物内共生真菌的研究才趋于活跃。自从A. Stierle证明Taxus brenifolia nutt中的内共生真菌Ｔaxomyces andreanae可以产生紫杉醇，对于植物内共生真菌的研究更加引人瞩目]。内共生真菌生产紫杉醇产量也极，这就需要。1.3本论文研究的内容 2.材料和方法 2.1.材料 2.1.1试剂葡萄糖 中国医药集团上海化学试剂公司麦芽糖上海生物化学试剂公司蔗糖上海化学试剂有限公司花生饼粉豆饼粉NH4NO3 AR 宜兴市第二化学试剂厂琼脂中国医药集团上海化学试剂公司蛋白胨 中国医药集团上海化学试剂公司酵母浸膏中国医药集团上海化学试剂公司MgSO4 AR 中国竟山区塔美化工厂KH2PO4 AR 无锡市民丰试剂厂 CHCl3 AR 宜兴市展望化学试剂厂CH3OH HPLC 上海陆都化学试剂厂pH 5.4~7.0 上海三爱思试剂有限公司 2.1.2培养基 种子培养基： 葡萄糖20g，花生饼粉3g，MgSO43g，KH2PO43g，NH4NO33g，配成1000ml。50ml/300ml瓶，0.1MPa（121℃）灭菌20分钟即得。 发酵基础培养基： 葡萄糖20g，花生饼粉10g，豆饼粉10g，MgSO43g，KH2PO43g，NH4NO33g，配成1000ml。60ml/300ml瓶，0.1Mpa（121℃）灭菌20分钟，即得。 2.1.3仪器 MGC-300H型智能型人工气候箱 上海一恒科技有限公司 LDZX-40型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂 超净台 无锡市空气净化设备厂 TDL-5-A冷冻离心机 上海东亭科学仪器厂 自动高速组织匀浆机 江阴市科研器械厂 旋转蒸发仪 星海生化设备有限公司 2.1.4实验材料 菌种：Y1117，本实验室保藏（未鉴定） 标准品：Paclitaxel，购自Sigma公司 3.实验方法 3.2优化指标 对发酵基础培养基碳源优化，其它成分不变如花生饼粉10g、豆饼粉10g、MgSO43g、KH2PO43g、NH4NO33g，配成1000ml。培养基碳源的优化考虑四个因素：葡萄糖和蔗糖的总浓度（其中以葡萄糖为主），葡萄糖和蔗糖占总糖浓度的比例，是否添加麦芽糖及其浓度，pH(消前，用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调整pH)。 根据所选用的是四因素三水平正交试验[]，把各因素、水平列成表 表 因素的水平 因素 水平 葡萄糖和蔗糖的总浓度（g/l） 比例 麦芽糖的浓度（g/l） pH 1 20 100:0 0 5.6(自然) 2 30 80:20 2 5.4 3 40 50:50 5 5.8 根据上表的因素和水平列成试验标 表 L9（34） 实验号 列号 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 2 3 9 3 3 1 1 3.3培养条件 种子培养 50ml/300ml瓶，放入摇床，100~120转/分，控温在20~25℃。 发酵培养 选取同一组种子液中生长较好的一份用移液枪移入发酵液中，60ml/300ml瓶，放入摇床，100~120转/分，控温在20~25℃。