能源科学进展之石油勘探和油藏描述的一种潜在新工具——微生物 DNA 探针应.pdfVIP

能源科学进展 2007,Vo3., No.2 石油勘探和油藏描述的一种潜在新工具——微生物 DNA探针应用 编译：滕小兰（西南石油大学研究生院） 审校：刘廷元 摘要：我们从油藏中分离出大量的微生物样本，但仅了解极少数微生物的生态学和其在油藏中的代谢作用。这 些代谢作用可能对石油质量和开采有着重要的影响。油藏的温度、压力、矿化度、PH 值和营养物等组成了独特的微生 物生存环境。尽管人们认为油层是缺氧的，但也有许多严格划分为需氧性的微生物被分离出来，并认为这些微生物是 本土起源的。最近，分子法被用来研究油藏微生物学，该法利用 16s rDNA 顺序和其它形式的直接序列信息，主要集中 于描述微生物群的多样性。我们的生物技术项目的 16s rRNA 基因库已经建立，库中的生物体来源于北海、南美和亚洲 的不同油田。从该基因库中已经筛选出与油气相关的特殊微生物，已被用于不同的 DNA 探针测试。有趣的是，我们从 相隔很远的不同的油田分离出了相同的细菌。本文将集中介绍一种新的非侵入性工具来寻找石油，并给出不同油气渗 漏区的油田样品和北海储层沉积历史的新证据。这种方法也可用于发现敏感地区的新油气，还可用于监测生产。 关键词：微生物 DNA探针 PCR 石油 1 引言 最近几年，Statoil 和 SINTEF 在 Statoil 生物技术项目中已经描述了世界上几个高温油藏的微生 物菌落，包括陆地泥火山，石油泄露处和海底烃类渗漏层。以这些发现为基础，我们建立了一个 16s rRNA 基因库，它可用作以下用途：a)比较油藏微生物菌落；b)以相关的天然石油环境解释微生物的作 用；c)发展基于基因的石油勘探方法；d)探测油藏微生物和工业生物催化剂中的酶。 本文将介绍这些研究的一些方法和成果，并以这些结果和方法为基础发展多套可用于石油勘探和 油井描述的 DNA 探针。对一些非依赖培养和依赖培养的描述微生物菌落的储层样品进行比较。 2 实验器材和步骤 样品 从不同位置选择样品，包括 a)北海和南美油藏；b)南美和亚洲的陆地烃类泄露处；c)北海海洋烃 类渗漏层。油井样品包括地层水、地层微粒、反复洗井和离心得到的油团以及勘探岩心。 当样品到达实验室后，将它们在厌氧罩里进行厌氧分离并立即处理，备份样品无菌包装后于 4℃ 下放于厌氧罩中保存。 培养 将一部分油藏样品在液体培养基上培养以选择性富集硫酸盐还原古细菌，产乙酸菌，产甲烷菌和 酵母菌。富集培养在储层温度(72～85℃)下进行。将富集培养物接种到固体培养基上以筛选分离出单 一菌落。富集培养和分离均在 80℃下进行。 核酸的提取和扩充 可用苯酸-录仿-异戊基乙醇提取核酸，也可用生产商提供的快速 DNA 旋转仪提取。 利用 PCR 技术扩充细菌和古细菌的 16s rRNA 基因片段。对于细菌，1480 个碱基对的完整基因和 56 个碱基对的部分片段均可扩充。但古细菌的 16s rRNA 基因片段只有 940 个碱基对或 180 个碱基对 可通过嵌套 PCR 扩充。不同 PCR 反应的引发物见表 1。 扩充产物描述 通过传统的琼脂凝胶电泳，阳性的 PCR 产物表现为单频条带。运用 DGGE 法在变性剂浓度为 20%～ 70%之间的连续梯度下对微生物菌落以及它们的多样性进行描述。运用 DGGE 分析时，先于 PCR 之前用 一种 40-mer 气相色谱板来预测引发物。DGGE 测线上的多样性可用 Ward’s Dice 系数的计算来量化。 各分离模式间的相似处可用树状图来比较。 - 12 - 能源科学进展 2007,Vo3., No.2 用克隆和序列分析的方法来确认不同样品中的微生物，将 PCR 产物提纯并用生产商提供的一套 PCR 克隆工具进行克隆。克隆的 PCR 片段与用 HaeⅢ和 Rsal(片段长度抑制剂 RFLP)抑制酶处理后的变 异体进行比较。以用 RFLP 处理的实验组为基础，选择克隆标本呈递给序列分析所