光损伤视网膜片培养上清液诱导大鼠骨髓间充质干细胞为视网膜样细胞研究.docVIP

光损伤视网膜片培养上清液诱导大鼠骨髓间充质干细胞为视网膜样细胞研究 　　[摘要] 目的：探讨大鼠视网膜片光损伤后诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成视网膜细胞的可能性。方法：实验研究。采用贴壁筛选法分离、培养SD大鼠骨髓MSC细胞，经流式细胞仪鉴定后，用大鼠视网膜片光损伤后的上清液与10%FBS的LG-DMEM以2:3混合成的条件培养液诱导MSC细胞7~8d。用免疫细胞化学染色和RT-PCR观察诱导后的细胞是否表达视紫红质、GFAP、NSE。结果：第3代MSC细胞经诱导后有（36.64±7.84)%表达rhodopsin, (20.21±6.47)%表达GFAP, (21.83±2.98)%表达NSE。RT-PCR鉴定结果分析示GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表达。结论：光损伤SD大鼠视网膜片培养上清液可诱导MSCs分化为视网膜样细胞。 　　[关键词] 骨髓间充质干细胞 视网膜细胞 大鼠 　　 　　成体干细胞中的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有多向分化的潜能，虽然其来源于中胚层，却可以跨胚层分化为外胚层来源的组织细胞，而视网膜则来源于胚胎期神经外胚层。MSC表达许多生长因子和细胞因子受体以及细胞与细胞黏附作用的受体，提示MSC的功能受自分泌和旁分泌循环的调控。这成为不同方法诱导MSCs定向分化的理论基础。组织或细胞在受到损伤后会进行自身修复，视网膜是接受光能，形成视觉的重要组织结构，如果光照强度或光照时间超过了视网膜的承受力，将会造成视网膜光损伤。本研究旨在用光损伤视网膜片的培养上清液体外诱导MSCs，看其损伤时分泌的细胞因子和分化所需蛋白是否能诱导MSCs分化为视网膜光感受器样细胞和视网膜神经细胞。探索体外构建MSCs分化成视网膜细胞所需微环境的理论可能性。 　　1材料与方法 　　1.1 实验动物 　　健康无眼病成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，体重120~150g（吴氏实验动物中心）。 　　1.2 大鼠视网膜片的取材 　　10%水合氯醛按0.3mL/100g腹腔注射麻醉，无菌状态下取出眼球。把眼球用10%FBS的LG-DMEM洗涤3次，去除球周筋膜组织，清洗干净后移入另一盛有10% FBS的LG-DMEM培养皿中，在解剖显微镜下，在角巩膜缘后1mm处剪开，用显微剪取出角膜、晶状体、玻璃体，留有外层覆盖巩膜的视网膜杯。把视网膜杯浸入培养皿中的培养液里，由杯缘向杯底，用显微镊钝性分离视网膜和巩膜，在视神经处剪断，彻底分离视网膜色素上皮层与视网膜神经上皮层。 　　1.3 大鼠视网膜神经上皮层常规石蜡切片HE染色 　　将大鼠视网膜片（只包含神经上皮层）常温浸泡甲醛24h以固定，常规脱水、透明、包埋、切片，常规脱蜡，行苏木素-伊红(HE)染色，封片。用数字摄像系统观察并采集照片。 　　1.4 视网膜片光损伤和条件培养液的制备 　　把分离好的4只眼球的视网膜神经上皮层移入另一盛有8mlNeurobasal+B27的小培养皿中（直径60mm）。用眼科显微剪把视网膜神经上皮层剪成1mm×1mm×1mm大小。在超净台内，50W,12V的卤素灯作为光源，采取直落式照射上述的小培养皿，用TES-1330A照度计测定光照强度，调整光源与培养皿之间的距离（3.5cm），使被照细胞同一水平的光照强度为(1950 ±200) Lux ,光照时该水平温度变化在0.5℃之内，持续光照45min，光照后将培养皿放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱继续培养1小时15min。用去针头的针筒吸出小培养皿中的液体，离心后上清液用0.22um滤器过滤，以2:3的比例与10%FBS-LGDMEM混合，并吹打均匀，制成条件培养液Ⅰ。条件培养液Ⅱ制备方法同条件培养液Ⅰ，只是视网膜片未经过光损伤处理，盛有Neurobasal+B27和视网膜神经上皮层的小培养皿直接放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养2小时。条件培养液Ⅲ为Neurobasal+B27和10%FBS-LGDMEM以2：3的比例混合，无视网膜片以及光损伤处理。三种条件培养液均放于-20℃保存。 　　1.5 视网膜神经上皮层光损伤后电镜观察 　　取材，3%戊二醛―1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸―1.5%亚铁氰化钾后固定，酒精―丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋；超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色，日立Hu-12A型（飞利浦208型）透射电镜观察、摄影。 　　1.6 大鼠MSC的分离和培养 　　取SD大鼠，麻醉后，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨，剔除周围肌肉组织。在超净台内，用PBS冲干净，转移到盛有20%FBS-LGDMEM的培养皿中，去除长骨2端骨骺，暴露骨髓腔。用培养液冲出骨髓腔