2010植物细胞培养3.ppt

* ●目前可以利用植物大规模细胞培养生产次生代谢物质种类主要包括紫草宁、紫杉醇等。 ●紫草宁在日本既作染料,也可用于创伤、烧伤、痔疮等治疗的药物。 * 新鲜的细胞被固定在床底部由聚丙烯酰胺等材料编织成的无菌平垫上。无菌液罐被紧固定在培养床的上方，通过管道向下滴注培养液。培养床上的营养液再通过蠕动泵循环送回中。 ⑵ 荧光染色法： 原生质体在荧光溶液中染色5-10分钟,离心、洗涤除去多余的染料，在荧光显微镜下观察（波长3600-4400A），发出绿光的为破壁不充分的原生质体，发出红光的为真正的原生质体（纤维素激发绿光）。 荧光液的配制： 0.1%荧光增白剂（VBL）配制在0.7M的甘露醇中。 四、原生质体活力测定 (p77) 1、染色法 ⑴ 二乙酸荧光素法（FDA):本身不发光的FDA进入细胞后，被酯酶分解成具荧光的物质。因此,具有活性的原生质体可发荧光,不发荧光者为死的原生质体。 ⑵ 酚藏花红染色法:0.01%的酚藏花红溶液染色收集纯化的原生质体,染为红色者为活原生质体，不着色者为死原生质体。 ⑶ 伊文思兰染色法: 0.25%的伊文思兰染色,不着色者为活原生质体，兰色者为死原生质体 2、胞质环流法 显微镜观察：胞质环流存在： 活原生质体 胞质环流不存在：死原生质体 3、渗透压法 活原生质体在低渗溶液体积增大，高渗溶液体积缩小；死原生质体体积无变化。 4、氧电极法 氧变化者：活原生质体； 无变化者：死原生质体。 活细胞光合作用放氧，呼吸作用耗氧 3.5.5 原生质体的培养 1971年，塔克比采用酶解的方法获得烟草叶肉原生质体，并经过培养再生出完整植株，从而首次证明了植物原生质体也具有全能性。 一、原生质体的培养方法 原生质体的培养方法类似于细胞培养方法。 1、固体平板培养法 2、液体培养法 3、双层培养法 1、固体培养 原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37?C左右）混合，培养于培养皿中。 优点： 由于原生质体被机械地彼此分开，并固定了位置，避免了细胞间有害代谢产物的影响并，便于定点观察并追踪单个细胞的发育过程。 （1）饲养层培养 方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合后加入0.6%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。 方法二：X-射线杀死原生质体，与0.6%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.6%琼脂混合，培养于饲养层上。 （2）共培养法 将生长迅速的原生质体培养物与难以培养的原生质体混合。 前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质。 2、液体浅层培养 用培养基离心 用培养基悬浮 3、双层培养法 培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。 固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。 固体培养基 液体培养基 已证明这种方法对烟草和矮牵牛原生质体的再生细胞起到了促进分裂的作用。考虑到有效地吸附培养物所产生的有害物质，在下层固体培养基中添加活性炭，结果使原生质体形成细胞团的数量提高了23倍。 很多实验已证实了琼脂糖比琼脂更适于进行原生质体培养，近年来又发展了琼脂糖固体培养和液体培养相结合的方法。 几种植物原生质体培养实验结果表明，尽管琼脂糖提高了植板率，但到细胞团阶段后就难以再继续发育。 原生质体培养 二、影响原生质体培养的因素 1、光照：培养初期黑暗或弱光（400-1500Lx）,愈伤组织形成后，增至2000Lx以上。 2、温度：根据不同的培养对象而定，培养初期,适当降低温度，细胞壁形成后，调至25度左右。 3、渗透压：需要用高渗培养基(0.6M甘露醇)。新壁形成后，逐步降低渗透压。 4、培养基：培养基成分对原生质体的培养影响较大,一般采用较全较富的培养基。 5、起始密度：原生质体的起始密度也是重要的影响因素。 6、原生质体游离材料的选择 7、预处理：低温黑暗处理，提高原生质体的得率和活率。 3.5.6 原生质体的发育和植株再生(p78) 一、细胞壁再生 一般情况下,原生质体在培养基中恢复3-4天,叶绿体重新排列,便开始新壁的合成，并由球形变成椭圆形。 二、细胞分裂 细胞的分裂需要细胞壁的参与。 三、愈伤组织或胚状体的形成 细胞分裂形成细胞团，并进而形成愈伤组织,或者诱导形成胚状体。 四、植株的再生 1、诱导胚状体：通过胚状体途径再生成苗。如胡萝卜的原生质体。 2、愈伤组织诱导：首先分裂形成愈伤组织，再分化成苗。一般先诱导芽的生成，然后再