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IEF聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) 两性电解质和pH梯度的形成 pH梯度的测定 样品等电点的计算 IEF原理 　　　 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing，简称IEF)原理： （1）两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。 （2）在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至周围的pH值等于该蛋白质的等电点处时，蛋白质此时不带电荷，停止泳动，进而被浓缩成狭窄的区带。 （3）常用的pH梯度电泳支持物有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用。支持物的作用是为了防止在正负极之间形成对流。 两性电解质（carrier ampholyte, CA) 两性电解质：由多种氨基与羧基比例不同的脂肪族多氨基多羧 酸同系物和异构物混合构成。当电场中通直流电时，它们依各 自氨基与羧基比例的不同而按其等电点的次序排列，从而在两 极间形成一个稳定的由阳极到阴极逐渐增加pH的平滑梯度。 商品名为Ampholine。 理想载体两性电解质的条件： 1、分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 2、可溶性好，便于等电聚焦过程中pH梯度的形成和蛋白质样品的迁移。 3、缓冲能力强，避免聚焦的蛋白质在等电点引起pH梯度的局部改变和溶解性能的下降。 4、导电性均匀，排除电场的不均匀而导致凝胶局部过热。 5、紫外吸收低，不发荧光。 6、化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 理想的载体两性电解质的合成 用具有几个pH值很相近的多乙烯多胺（如五乙烯六 胺）为原料，与不饱和酸（如丙烯酸）发生加合反应：加合 反应优先加在α、β饱和酸的β碳原子上，调节胺和酸的比 例可以加上一个或多个羧基，这种合成方法与一般有机合成 不同，有机合成一般要求合成的产物愈纯愈好，而这里要求 合成出的产物愈复杂愈好，要有多异构物和同系物，以保证 的很多具有不同而又互相接近的pK值和pI值，从而得到平滑 的pH梯度。 载体两性电解质的等电点在pH3-10的范围，分子量在 300-1000之间，它们的缓冲能力等于或优于组氨酸，电导性 能良好，可以使电场强度分布较均匀，它们的水溶性良好， 在1%水溶液中的紫外吸收值（260nm）很低。 （1）正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物（即在灌制聚丙烯酰胺凝胶的时候将两性电解质加到未聚合的凝胶中，聚合后，在凝胶中即形成了两性电解质的混合物）； （2）在正极端引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。 （3）电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。 （4）电泳开始后，混合物中pI最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。 （5）由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。 （6）pH稍高的第二种两性电解质，其等电点为pI2，也移向正极，由于pI2＞pI1，因此定位于第一种两性电解质之后。 （7）以此类推，经过一定时间后，具有不同等电点的两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递增，由低到高的线性pH梯度。 IEF的优点和应用 优点：分辨率高（0.01pH），抵消扩散作用，可使很稀的样品达到高度的浓缩，并同时测定等电点。特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分 。 缺点：1、聚焦要求用无盐溶液，在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀， 2、样品中的成分必需停留于其等电点，不适用在等电点不溶 或发生变性的蛋白质。 应用：1、分析和制备。 2、测定等电点。 注意：有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应预先除去。蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大，易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸碱，占据了分离的有效部位。色素和酚类物质也会影响结果。同时要加入蛋白质水解的抑制剂。此外，两性电解质的好坏是聚焦好坏的关键之一。加样体积不受限制，最高可达80-85毫升。 双向电泳图谱 电泳装置 操 作 方 法 1. 凝胶柱的制备 （1）玻璃管先用小片的封口膜封口，然后将封口的一端插在橡皮帽中(与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可在橡皮帽中先加2-3滴30%的甘油或者40%蔗糖) （2）配胶 （按照黑板上的配方加入相应的溶液）