血红蛋白的提取和分离(二).ppt

绪 1.差异性 2.来源和性质 3. 20 、 、4、2个α 、2个、亚铁、一分子 氧、 一分子二氧化碳 4.血红蛋白含量丰富，容易获取。 课题3 血红蛋白的提取和分离 ——实验操作要领 知识目标： （1）描述凝胶色谱分离蛋白质的步骤； （2）理解进行样品的预处理的目的； （3）运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。 重、难点： （1）描述凝胶色谱分离蛋白质步骤； （2）运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。 题目： （1）探究问题1、2、3 （2）自己存在的其他疑问 要求： （1）小组长搞好组织调控：先一对一讨论，再组内跨层 交流；重点讨论答案的科学性； （2）讨论形成的答案要条理清晰、要点化、序号化。帮 助展示同学做好展示准备。 A层 解决全部疑难，并帮助B层完善答案, 帮助其他同学解决疑难点。 B层 解决疑难后，负责展示。 C层 解决疑难，狂记导学案自主学习部分。 （1）记忆凝胶色谱分离蛋白质的步骤； （2）理解进行样品的预处理的目的； 学科助理：1.回扣目标 总结收获 2.评出优秀小组和个人 * 请核对导学案答案 （一）样品处理及粗提取 1.样品处理 、粗分离、纯化 和纯度鉴定。 2.血浆、、杂蛋白、、柠檬酸钠、、五、生理盐 水、缓慢、低速短时、上清液没有黄色 3.红细胞、等、蒸馏水、甲苯、磁力搅拌器 4.血红蛋白、高速离心、无 、甲苯、白、脂溶 性沉淀、红 、血红蛋白溶液、暗红、破碎物沉 淀、滤纸、脂溶性沉淀、分液漏斗、血红蛋白 溶液 5.无机盐离子、有机小分子、透析袋、磷酸缓冲 液 （二）凝胶色谱操作 2.交联程度、膨胀程度和分离范围、得水值、 7.5、蒸馏水、均匀 、气泡、磷酸缓冲液 、 紧密 。 3.管壁、凝胶面、色谱柱底部、5 （三）操作提示 1.白细胞 2.洗脱液、沸水浴、微生物、空气 3.扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序 请拿出课本、双色笔、导学案 让我们准备好进行思维的碰撞 回顾： 1.凝胶色谱法和电泳的基本原理？ 2.缓冲溶液的作用？ 请3组A1阐述 请5组A2阐述 凝胶色谱法分离蛋白质的原理（根据分子量的大小） 相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部通道，路程较长移动速度较慢； 相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，路程较短移动速度较快； 相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 凝胶电泳的原理 带电粒子在电场的作用下发生定向迁移，在加入SDS排除电荷多少的影响后，使电泳迁移率完全取决于分子大小，从而达到分离的目的。 全班同学一起朗读 蛋白质提取和分离步骤 具体操作 步骤 （一） （二） （三） （四） 哺乳 血液 血 浆 水 分 固体物质 血浆蛋白 无机盐 磷 脂 葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （ ） 90％ 有没有，多不多，易不易 1.洗涤红细胞 1.1 洗涤的目的：洗去血液中血浆及血小板等中的杂蛋白 1.2 洗涤过程： 血液 100mL 3g柠檬酸钠 低速离心 2 min 红细胞 血 浆 吸出血浆 红细胞 5倍体积生理盐水 缓慢搅拌10min 重复洗涤3次，直至上清液没有 防止破坏红细胞，使血红蛋白流失 （一）样品处理 黄色 2. 血红蛋白的释放 原理：红细胞渗透作用吸水涨破，释放血红蛋白 3.分离血红蛋白溶液 分离过程： 红细胞 混合液 离心管 甲苯层 脂类物质 血红蛋白层 破碎物沉淀层 高速离心 10min 滤纸 过滤 脂类物质 沉淀物 烧杯 分液 漏斗 20mmol/L磷酸缓冲液 透析的目的是什么？ 1mL 1mL 1mL 去除血红蛋白中的小分子杂质 （二）粗分离——透析血红蛋白 ★注意事项★ （1）生理盐水作用？ （3）两次离心的差异？ （4）透析袋的作用机理？ 模拟红细胞生存环境，保持红细胞结构完整。 破碎红细胞；溶解细胞膜 释放血红蛋白。 前慢后快，前短后长。 渗透作用 （2）蒸馏水和甲苯的作用？ （三）纯化 1.凝胶色谱柱的制作 （2）规格：玻璃管——长40cm，内径1.6cm，两端磨平； 橡皮塞——能塞入玻璃管，上平小凹； 移液管——0.5mL，长5cm； 尼龙网——100目； 打孔