人教版高中生物选修一5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段课件2共28张PPT.ppt

多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。 脱氧 核糖 含氮碱基 磷酸 A G C T 1、DNA的基本单位－脱氧核苷酸 一、DNA分子的结构 1 2 3 4 5 O 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 2、脱氧核苷酸的种类 A 腺嘌呤脱氧核苷酸 G C T A T G C A G C T 3、DNA分子的平面结构 氢键 5端 3端 5端 3端 4、DNA的立体结构  ——双螺旋结构 2、时间： 细胞分裂间期（有丝分裂间期，减数第一次分裂的间期） 1、概念：以亲代DNA为模板，根据碱基互补配对合成子代在DNA的过程。 3、场所：主要是细胞核 （其次是线粒体、叶绿体） 二．细胞内DNA复制的过程 4、 条件： ① 模板： 亲代DNA的两条母链 ② 原料： 游离的四种脱氧核苷酸 ③ 能量： ATP ④ 酶： 解旋酶 、DNA聚合酶 ⑤ 引物：一小段RNA，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对 5、过程 （1）解旋：解旋酶 、ATP （2）以DNA的两条母链为模板，根据碱基互补配对规则，合成子链。 （3）子链、母链螺旋构成子代DNA DNA体内复制（示意） 6、复制特点 半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。 7、DNA复制的方向 DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸 条件 组分 作用 模板 DNA的两条单链 提供复制的模板 原料 四种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料 酶 解旋酶 TaqDNA聚合酶 不需要 催化合成DNA子链 能量 ATP 不需要 引物 一般是一小段DNA 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸 1、PCR的技术（DNA体外复制）的条件 DNA双链 单链 变性（加热80-100℃ ） 复性（缓慢冷却） 一、PCR的原理（ PCR的技术原理） 一、PCR的原理（ PCR的技术原理） 1 2 3 4 5 22 55 72 94 时间（min） 温度 （℃） 适温延伸 高温变性 低温复性 重复1~3步30轮 3、DNA复制的方向 DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸 2、步骤：变性 ——复性——延伸 PCR技术的原理总结 利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。 体外DNA复制的条件： 四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、 模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。 复制的方向：子链的5’端向 3’端延伸。 二、PCR的反应过程 5/ 3/ 3/ 5/ 5/ 3/ 引物Ⅰ 5/ 3/ 引物Ⅱ 变性95oC 复性55oC 延伸72oC 5/ 3/ 3/ 5/ 5? 引物1 5? 引物2 第二次复制 第一次复制 5? 5? 5? 5? 5? 5? 模板DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。 每个循环包括：变性 ——复性——延伸 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。 PCR的反应过程总结 三、 PCR反应的实验操作 1、PCR仪 设备及用具 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 实质上一台能够自动调控温度的仪器 三、 PCR反应的实验操作 （1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备） （2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液） （3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合） （4）将微量离心管放在离心机上（离心） （5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应） 循环数 变性 复性 延伸 第一次 94°C,10min － － 30次 ９4℃，30s 55℃，30s 72℃，1min 最后一次 ９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min 四、结果分析与评价 DNA 含量的测定：稀释→对照调零→ 测定→计算（公式见P63） 波长260nm处读数 蒸馏水做对照 50倍 （一）理论上DNA扩增数目的计算 四、课题成果评价 1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n 2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n （二）实验中DNA含量的测定 1 、原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA