小鼠睾丸生精细胞凋亡相关新基因mtsarg3及人类同源基因tsarg6的克隆及初步功能研究-遗传学专业论文.docx

摘要人类睾丸是一种具有高度增殖能力的组织，但成年睾丸中产生的成熟精子的数量要比预计生成的精子数少20—75％。大量研究表明睾丸中生精细胞这种自发性退化是通过凋亡而发生的。凋亡除在正常精子发生中自发进行外，还可以被多种调节性信号诱发产生，其中热压是诱导凋亡的一个重要因素。凋亡调控的紊乱是特发性男性不育症的一个重要决定因素。克隆新的生精细胞凋亡相关基因，深入了解生殖细胞凋亡的调控机制，明确外界死亡信号触发生殖细胞凋亡的信号传递通路以及各通路之间的相互联系，将有助于阐明人类雄性不育的分子机制，为治疗男性不育症及开发新的避孕药物提供理论依据。本室姜宏等通过建立小鼠隐睾模型，运用抑制消减杂交法(sSH)克隆出24个小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因的EST，并在GenBank中登录。本研究利用genescan技术和PCR等实验方法，从上述EST中的BE644537出发，成功地克隆了小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因历例腮，和人类同源基因TSA朐，并对其进行了初步的功能研究。本研究分为四个部分，其主要实验方法及实验结果如下：第一章mTS姗G3基因的克隆与生物信息学分析从在小鼠隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段(BE644537)出发，利用genescan软件分析该片段所在染色体基因组序列，获得一个包含该EST的新基因序列。设计该基因特异性引物从小鼠睾丸eDNA文库中进行PCR扩增，分离出小鼠睾丸生精细胞凋亡相关基因mTSARG3(GenBank登录号为AF419292)。该基因定位于小鼠7号染色体7E1一E2区带，全长为11 kb，cDNA全长为1328 bp，包含8个外显子，编码由316个氨基酸组成的、分子量为36KD的蛋白质。该蛋白含有DnaJ区和DnaJ_c区，与热休克蛋白40家族多种蛋白有较高相似性，其中与小鼠DJB4_MOUSE在336 aa的范围内有46％的相似性，属热休克蛋白40家族新成员。Northern结果显示该基因在小鼠睾丸组织高表达，转录本大小约为1．35kb。第二章盟例嬲了基因功能的初步研究多组织RT-PCR结果显示肌删月67基因在成体睾丸组织特异表达，与Nonhem结果相符，进一步证实其睾丸表达特异性。为研究mTSARG3基因在精子发生中的调节作用，我们分离了小鼠不同发育阶段的睾丸总RNA进行半定量RT-PCR检测，结果显示mTSARG3基因在出生小鼠1周即有表达，在第3周时明显增高，之后保持稳定表达趋势。原位杂交实验验证以上结果，提示mTSARG3表达增强与精母细胞的出现有关，该基因可能参与精原细胞分化形成精母细胞的减数分裂过程。为研究mTSARG3基因在精子凋亡中的作用，我们通过隐睾手术建立了小鼠隐睾模型，分离不同天数小鼠隐睾模型睾丸组织总RNA进行半定量RT-PCR检测，结果显示mTSARG3基因和HSP70-J基因在术后逐渐表达增加，达到高峰之后又逐渐下降，HSP70-1表达高峰早于mTSARG3，原位杂交实验验证以上结果，提示两基因的表达增强与热诱导的凋亡有关，mTSARG3(HSP40家族新成员)可能通过DnaJ区与HSP70-I结合，协助HSP70-1在热休克应激环境下发挥抗凋亡作用。Southern杂交结果显示mTSARG3基因在正常睾丸和隐睾组织中均为单一条带，大小约为20kb，与预测相符，提示mTSARG3基因在正常睾丸和隐睾组织中无断裂和重排。我们将构建的pEGX-KG／mTSARG3和PQE30／mTSARG3原核表达质粒转化大肠杆菌，IPTG诱导后特异高效表达。利用兔抗GST抗体和兔抗mTSARG3抗体对原核表达产物进行了westernblot检测，表明原核表达蛋白为预测融合蛋白。将PQE30／mTSARG3原核表达产物进行纯化，SDS显示纯化后产物是分子量为36kD的蛋白。免疫组化和原位杂交结果显示mTSARG3基因主要在初级精母细胞和次级精母细胞中表达，进一步验证了其生精细胞表达特异性。II利用pEGFP—C3真核表达系统，将mTSARG3编码蛋白定位于细胞质，与生物信息学预测结果相同。流式细胞仪分析结果提示mTSARG3提高细胞合成速度，促进细胞增殖。第三章TSARG6基因的克隆与生物信息学分析从在小鼠隐睾和正常睾丸对照中表达量有明显差异的EST片段(BE644537)出发，通过生物信息学方法获得人类同源EST,利用genescan软件分析该片段所在染色体基因组序列，获得包含该EST的一个新基因序列。设计该基因特异性引物从人类睾丸eDNA文库中进行PCR扩增，分离出人类睾丸生殖细胞凋亡相关基因TSARG6(GenBank登录号为AYl38810)。该基因定位于人11号染色体1lql3．3区，eDNA全长为1875bp，包含8个外显子，编码由316个氨基酸组成的、分子量为36KD的