栉孔扇贝(chlamys farreri)幼虫和成体组织细胞的体外培养体系建立和特征分析-海洋生物学专业论文.docx

摘要探索海洋贝类细胞培养体系建立方法的研究是一项意义重大且负有挑战的课题。一方面体外细胞培养体系是阐明养殖病原微生物致病机制、细胞分子育种、功能基因的深入研究等诸多科研领域急需的实验工具；另一方面，目前在世界范围内，尚未建立针对海洋贝类生物细胞培养的成熟方法。本研究旨在建立一种适用于海洋贝类的细胞培养方法，提高贝类细胞培养体系的研究应用能力。本文以中国北方重要的经济贝类栉孔扇贝为实验对象，选取多种细胞类型进行体外培养体系建立的研究。以优化培养条件的传统方法为基础，通过添加因子和外源基因导入等手段诱导细胞转化，建立了栉孔扇贝担轮幼虫和成体组织细胞体外培养体系；进一步对栉孔扇贝幼虫体外传代培养细胞的特性和功能进行了初步分析。主要结果如下：本文通过优化细胞解离方法、向基础培养基中添加诱导因子等，有效地促进和维持了体外培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞的增殖能力和长期存活，成功地实现了幼虫细胞在体外传代培养19代。研究发现：使用无钙海水配以机械法获得的解离细胞活力明显高于使用胶原酶和胰酶酶解获得的细胞；添加适宜浓度的胎牛血清可提高细胞的有丝分裂能力和贴壁能力；添加适宜浓度的栉孔扇贝血清可提高体外培养细胞的贴壁能力和维持细胞形态；添加适宜浓度的卵黄提取液可促进传代培养后期细胞的增殖和贴壁能力；EGF和bFGF生长因子组合的添加可有效延长细胞寿命并维持细胞形态。担轮幼虫细胞体外培养体系中主要包括3 类细胞，分别是圆形透亮细胞、圆形颗粒大细胞和圆形黑色小细胞；其中圆形透亮细胞具有最佳的生理状态，如在Percoll分离后体系中，该种类细胞于12h后即可贴壁且分裂速度较快。但整体而言，3 类细胞的增殖能力和贴壁能力均随体外培养时间的延长呈现逐渐减弱的趋势。进一步，通过栉孔扇贝ITS序列扩增鉴定所获体外传代培养物属于栉孔扇贝细胞。使用流式细胞仪检测了栉孔扇贝担轮幼虫原代、第12 代和第18 代体系中S 期细胞的比例，显示随着体外培养细胞传代次数的增加，S期细胞所占的比例逐渐降低；采用原位杂交技术比较了栉孔扇贝担轮幼虫体外培养原代细胞和传代细胞中piwi（参与维持细胞的自我更新特征）和phb2（细胞周期中抑制G1 期向SI期的过度）基因的表达，结果显示：栉孔扇贝担轮幼虫原代和传代培养体系中的3 类细胞均可表达piwi和phb2基因；其中piwi基因在原代培养细胞胞质中的阳性信号较第16 代细胞的致密；phb2 基因在第16 代细胞中的表达明显强于原代细胞；呈现出随培养代数增多细胞的增殖能力逐渐衰退。采用免疫组织化学技术揭示了体外培养细胞肌凝蛋白（细肌丝成分），5 羟色胺（神经递质成分），肌动蛋白和微管蛋白（细肌丝或细胞骨架成分）等的表达，发现栉孔扇贝幼虫细胞体外培养至16 代时，细胞中肌凝蛋白的表达较原代培养细胞时期更加显著，暗示该时期细胞有向肌细胞分化的趋势，但其分化时间较正常发育的担轮幼虫细胞晚。本次我们未在体外培养的幼虫细胞中检测到神经递质5 羟色胺的表达，与正常发育的中后期担轮幼虫头部区细胞首先检测到两个表达位点的结果不一致。本研究采用优化培养体系的方法，建立了栉孔扇贝血淋巴、鳃、卵巢、精巢、心脏等成体组织细胞的原代培养体系，各种组织细胞均可在体外存活2.5周以上；进一步，尝试了脂质体（Lipo2000）、阳离子聚合物（PEI）和慢病毒介导外源基因SV40LT（猿猴病毒大T抗原基因）诱导体外原代培养细胞的转化，其中慢病毒感染法对细胞伤害最小，转染效率最高可达到25%，能够使转基因后的贝类体外培养细胞的平均存活寿命显著延长，并在病毒感染后的心脏细胞培养体系中发现细胞分裂相。综上，本研究所建立的扇贝幼虫体外传代培养技术和外源基因导入方法，将为贝类细胞永生化细胞系的建立提供重要的基础数据，有望在功能基因研究、分子育种、病害防治和环境毒理学等领域发挥重要的作用。关键词：栉孔扇贝；细胞培养；传代培养；转基因；幼虫和成体组织Establishment andCharacteristicAnalysis ofLarvalandTissueCellsinvitroinChlamysfarreriAbstractItissignificantandchallengeablefieldtoexplorethetechniquesestablishingcell linesinmarinemulloscs.Theculturesystemsand/orcelllinesareurgentlyneedto researchin pathogenicmechanismofaquaclulturepathogenicmicroorganisms,celluar andmolecularbreeding,genefunction,etc.However,nopracticalte