人肝内胆管上皮细胞凋亡新生抗原与原发性胆汁性肝硬化胆管特异性损伤相关性的分析-临床医学、临床检验诊断学专业论文.docxVIP

摘要凋亡（Apoptosis），又称程序化细胞死亡，是机体维持自稳状态最重要的机制之一。健康成年人每天平均有500亿至700亿个衰老、恶变、或损伤的细胞发生凋亡，绝大部分凋亡细胞在启动凋亡程序后裂解为凋亡小体（apoptoticbody），凋亡小体被局部吞噬细胞识别并以一种非炎性的方式清除，同时新生细胞得以再生并籍此维持组织稳态。理论上说凋亡是一种近乎完美的机制，但近年来，已有研究证实体细胞非正常凋亡与自身免疫性疾病有着千丝万缕的关系，凋亡小体中包含的细胞内成分如果没有经过有效的加工可能无法被吞噬细胞识别处理从而形成新的自身抗原，这种特殊的自身抗原被称为凋亡新生抗原，其英文名apotope则源自凋亡（apoptosis）和抗原表位（epitope）。凋亡新生抗原的产生多由于靶细胞存在特异性分化缺陷，凋亡后无法加工分解某一类自体蛋白，导致该类蛋白经由凋亡小体长期在局部吞噬细胞和抗原递呈细胞中积累，并最终打破免疫耐受成为自身抗原，导致器官特异性自身免疫损伤。原发性胆汁性肝硬化（primarybillarycirrhosis，PBC）是一种典型的器官特异性自身免疫性疾病，主要累及中年女性，在欧美40 岁以上女性中发病率达到千分之一，在我国发病率也呈逐年上升的趋势。PBC 的主要病理学特征为免疫细胞特异性识别并杀伤肝内胆管上皮细胞（humanintrahepaticbiliaryepithelialcells，HiBEC），导致肝内小胆管渐进性消失，肝内胆汁淤积致肝组织反复再生并发生纤维化，最终导致肝硬化和肝功能衰竭，PBC整个病程长达20年以上，除部分晚期患者进行肝脏移植外，目前尚缺少有效治疗手段。免疫学方面，PBC 患者血清中存在高滴度自身抗体，目前已鉴定的自身抗原主要包括位于线粒体内膜的丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(PDC-E2)，2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2亚基(OGDC-E2)和支链2-氧酸脱氢酶复合体(BCOADC-E2)，除自身抗体外，PBC患者体内也发现PDC-E2抗原特异性T细胞。目前在PBC研究领域最重要的一个问题是：PDC-E2等自身抗体广泛存在于各类有核细胞，为什么PBC患者的免疫系统却特异性攻击HiBEC细胞？换言之，免疫学研究需要解释发生在PBC中的器官特异性问题。为解决这一问题，结合凋亡新生抗原理论，本研究提出以下假说并利用实验验证：人HiBEC细胞存在缺陷，导致某些线粒体内膜蛋白在凋亡后无法降解，这些无法降解的蛋白通过凋亡小体被肝内吞噬细胞和抗原递呈细胞捕获并递呈，导致自身抗原外漏并可能最终引起免疫耐受的缺失引发疾病。在此基础上，我们还想证明这些包含有PBC特异抗原的凋亡小体是否具有免疫原性，在PBC状态下，我们认为凋亡的胆管上皮细胞释放的凋亡小体主要可能影响2 种细胞即专业吞噬细胞如巨噬细胞，树突状细胞和非专业吞噬细胞如胆管上皮细胞本身，已有报道证实PBC患者的巨噬细胞在胆管上皮细胞和凋亡小体和抗线粒体抗体同时刺激的情况下会大量释放促炎性细胞因子，而胆管上皮细胞本身是否介入凋亡细胞的清除，如果介入，这些包含自身抗原的凋亡小体对胆管上皮细胞又有何影响？上述问题的解决将会更合理的解释PBC中胆管上皮特异性损伤，并有助于揭示PBC 更细致的免疫致病机制，为可能免疫学治疗提供介入位点。第一部分肝内胆管上皮细胞的原代培养及凋亡的诱导在此部分中研究中，我们主要建立了人HiBEC细胞，人乳腺上皮细胞，人支气管上皮细胞和人表皮细胞的原代培养体系。人HiBEC细胞经细胞角蛋白18，19免疫荧光染色鉴定阳性率达90%以上。在此基础上我们分别利用亲水性胆盐甘氨鹅脱氧胆酸钠（sodiumglycochenodeoxycholate，GCDC），紫外辐射，以及抗Fas抗体诱导上述四种原代培养细胞凋亡。结果表明GCDC可有效诱导四种原代培养细胞系发生凋亡，经浓度梯度实验证实GCDC在1mM时给药4小时可以诱导达高达90%的人HiBEC细胞发生凋亡，同样的条件也可以有效诱导约其他3种原代细胞发生凋亡（凋亡率40%-50%）；而紫外辐射(强度1650J/m2至2200J/m2)仅能诱导约25%原代细胞发生凋亡；尽管四种原代细胞表面均有较高强度的Fas表达，但给予Fas抗体却几乎无法诱导凋亡。亲水性胆盐为人胆汁内主要毒性成分，利用GCDC诱导胆管上皮细胞凋亡较好的模拟了PBC中胆管上皮细胞的病理性凋亡。我们随后利用超速离心收集了培养上清中的凋亡小体用于下一阶段凋亡新生抗原的研究。第二部分肝内胆管上皮细胞凋亡新生抗原的鉴定在此部分的研究中，我们分离了4种细胞经GCDC 诱导凋亡后的凋亡小体，并利用免疫印迹和激光共聚焦显微镜研究了3 种PBC 特异性自身抗原（PDC-E2,OGDC-E2,BCOADC-