细菌耐药基因芯片检测技术的初步研究.ppt

P 阳性对照 N 阴性对照 B 空白对照 … 预留位置 基因芯片点阵图 KPC CTX-M VIM IMP 基因芯片扫描图 aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia OXA-23 DHA qnrS 基因芯片扫描图 SHV TEM qnrB mecA 基因芯片扫描图 ParC野生型 GyrA突变型(D87-N87) aac-Ib突变型 aac-Ib野生型 基因芯片扫描图 肺炎克雷伯菌-8 阳性耐药基因依次为：CTX-M、KPC、CIT、TEM、SHV、DHA 多耐药基因菌株基因芯片扫描图 大肠杆菌-8 阳性耐药基因依次为：CTX-M、TEM 多耐药基因菌株基因芯片扫描图 铜绿假单胞菌-42 阳性耐药基因依次为：VIM、TEM 多耐药基因菌株基因芯片扫描图 MRSA-1 阳性耐药基因依次为：mecA、TEM 多耐药基因菌株基因芯片扫描图 基因芯片检测G-杆菌耐药基因情况 基因芯片检测G-杆菌突变基因位点 5株大肠杆菌的aac(6’)-Ib野生型(535 G) ； 3株存在aac(6’)-Ib的535位碱基G到T突变； 1株大肠杆菌GyrA突变型(N87)； 1株大肠杆菌ParC野生型(E84) ； 其余菌株的这3种耐药相关基因，均未检到野生型与突变型。 4株MRSA中，耐药基因TEM、mecA阳性率均100%，1株同时检出耐药基因aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia，其余基因检测均阴性； 4株HLGR中，耐药基因aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia 阳性率为100% ，其余耐药基因均未检出。 基因芯片检测G+球菌耐药基因情况 本耐药基因检测芯片，对耐药基因TEM、SHV、CTX-M、DHA、CIT、IMP、VIM、KPC、OXA-23、qnrB、qnrS、 aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia、mecA 检测的灵敏性、特异性均为100%，与PCR结果一致。 耐药基因芯片的评价 突变位点检测结果与测序一致： aac(6’)-Ib 535G 位点 aac(6’)-Ib 535 T位点 GyrA N87 突变 ParC E84野生型 耐药基因芯片的评价 突变位点检测结果与测序不同： aac(6’)-Ib基因 T304 野生型与突变型 GyrA 其余突变型 ParC 突变型 耐药基因芯片的评价 结 论 检测范围覆盖临床常见的5种革兰氏阴性杆菌和2种革兰氏阳性球菌； 不需进行菌种鉴定，可直接进行耐药基因检测； 覆盖16种常见耐药基因，充分体现基因芯片的高通量性和并行性； 除3个突变相关基因的部分位点检测效果不佳外，对其他耐药基因检测结果与PCR完全一致。 芯片对突变相关基因检测结果，考虑以下原因：样本本身不含该基因、引物及探针设计等问题；结合已测序样本结果，还可能存在测序样本量小等原因。 本研究未对DNA浓度进行梯度测试，鉴于基因芯片高度灵敏性的特点，可以对本耐药基因检测芯片进一步进行灵敏度方面的研究。 引入数字PCR、NASBA、LAMP技术提高实用性。 数据处理方面，寻求能够建立药敏信息和基因信息对应的处理方式。 问题与展望 * * 超级细菌的出现是细菌多重耐药性上升大背景下的一个必然现象。自1939年抗生素问世以来，抗生素是医院临床中应用最广泛的药物之一，在控制、预防和治疗各种感染性疾病中发挥重要作用。然而，近10年来，细菌耐药率迅速增长，医院内感染时尤其严重。各种耐药菌的不断出现可造成严重后果，例如，导致手术治疗失败、并发症增多、感染复发、住院时间延长、昂贵抗生素及其它药物的使用量增加等，耐药细菌株还随着国际贸易及旅游业的高速发展而在全球范围蔓延。 * 这是传统细菌鉴定流程，从标本接种、可疑致病菌的分离、鉴定到药物敏感试验一般需要48至72小时，其中样本接种需要24小时，分离纯化需要24小时，细菌鉴定和耐药检测需要24小时，繁殖速度慢的细菌则检测时间更长。由此产生的致病菌信息的缺乏会影响到临床医生的及时、正确用药。因此，如何快速、准确地检出病原菌、同时明确其耐药情况成了医疗领域追求的目标。 * * 本研究的目标是同时实现对7种常见病原菌（铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、肠球菌）和16种耐药基因（TEM、SHV、CTX-M、Mox、Cit、Dha、Acc、Ebc、fox、gyrA、parC、aaC(6’)-Ib-cr、mecA、imp、vim、OXA23）的检测。 HLGR:庆大霉素高水平耐药肠球菌 * * 检测过程时间短，其中DNA提取需要1小时，靶基因扩增需要2小时，杂交反应时间在2小时，总计时间控制在6-8小时。 细菌耐药基因芯片检测技术的初步研究 宁波市第二医院