酶促反应动力学参数的测定.PDFVIP

酶促反应动力学参数的测定 钟成 副教授 生物工程学院 实验目的 1.学习测定米氏常数Km值的原理 2.掌握测定米氏常数Km值的方法 3.了解底物浓度对酶促反应的影响 1 实验意义 1、Km是酶的特性常数之一，测定Km值是酶 学研究的一个重要方法。 2 、理解Km值与酶促反应速度之间的相互关 系。 实验原理 Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应 速度一半时所对应的底物浓度。 实验原理 Km 的意义 Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同， 同一种酶与不同底物反应Km值也不同。 Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小： Km 值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大。 测定Km值是酶学研究的一个重要方法。大多数 纯酶的Km值在0.01-100mmol/L。 实验原理 内容 r C max s 米氏方程：r  K C m s 式中：C ——底物浓度（微摩尔浓度变化/min ） s r ——反应速度（微摩尔浓度变化/min ） rmax——最大反应速度（mol/L） Km——米氏常数（mol/L） 此方程表明，当已知Km及rmax时，酶反应速度 与底物浓度之间的定量关系。 实验原理 Linewaeaver-Burk 作图法（双倒数作 图法）测定Km值： 1 K 1 1 m    r r C r max s max 实验原理 胰蛋白酶的性质： 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精氨 酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解，产生 自由氨基端。 用甲醛滴定法测定氨基酸，甲醛可与氨基酸 + + 上的—N H 结合，形成羧甲基衍生物，使N H 游 3 3 + + 离出来，这样就可以用碱滴定N H 放出H ，测出 3 氨基酸。 实验原理 氨基的测定——甲醛滴定法