乳粉中克雷伯氏菌检测的方法的研究.pptVIP

常规检测方法 检测方法研究 * 常规检测方法 检测方法研究 * 常规检测方法 检测方法研究 * 检测方法研究 常规检测方法 4. 各种分离培养基在乳粉普查中的应用 方法： 采用VRBGA、SCAI和MAIC作为分离培养基，对100份进口乳粉进行克雷伯氏菌的分离。每份样品取3×100g，分别溶于900mL灭菌蒸馏水中，37℃预增菌（18～22）h，转种10mL到90mL EE肉汤中，37℃增菌（18～22）h，四区法涂布平板。 * 结 果： 分离平板 可疑菌落数 阳性菌落数(%) VRBGA 46 7(15) SCAI 11 7(64) MAIC 9 7(71) * 检测方法研究 常规检测方法 5. 肺炎克雷伯氏菌检测流程图 * 样品100 g×3，10 g×3，1 g×3加入9倍量的无菌蒸馏水 或样品100 g×3加入900 mL无菌蒸馏水 10 ml加入90 mL肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤） MAIC 动力试验 荚膜染色 革兰氏染色 氧化酶试验 API 20E 生化鉴定 或 VITEK生化鉴定 报 告 * 分子生物学检测方法的研究 检测方法研究 1 肺炎克雷伯氏菌荧光PCR检测方法 引物设计：在16S-23S间区序列设计5条引物组合成5对，经试验筛选出一对引物具有较好的特异性及灵敏度。 * 分子生物学检测方法 检测方法研究 CGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTACCTTAAAGAACCTGCCTTTGCAGTGCTCACACAGATTGTCTGATGAAAAACAGCANTNAAAACCTCTACAGGCTTGTAGCTCAGGTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCGGTGGTTCAAGTCCACTCAGGCCTACCAAATTTGCGAAGCAAATTTGAAGAGGTTGCAAACGATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGGAGGTCTGCGGTTCGATCCCGCATAGCTCCACCATCTTTACTGCGAACACAAGAAAACTTCAGAGTGAACCTGAAAAGGTGCACTGCGAAGTTTTGCTCTTTAAAAATCTGGATCAAGCTGAAAATTGAAACGACACACAGTTAATGTGTGTTCGAGTCTCTCAAATTTTCGCAATCAGAAGTGAAACATCTTCGGGTTGTGAGGTTAAGCGACTAAGCGTACACGGTGGATGCCCTGGCAGTCAGAGGCGATGAAGGACGTGCTAATCTGCGAAAAGCGTCGGTNAGGTGATATGAACCGTTANANCCGGCGATGTCCNAATGGGGAAACCCAGTGCNATTCGTTNCACTATTCGTAACTGGATACATAGGTTAACGAGGCGAACCGGGGGAACTGAAACATCTAAGTACCCCGAGGAAAAGAAAANAANCGGG * 肺炎克雷伯氏菌荧光PCR特异性试验 10株肺炎克雷伯氏菌的标准株及野生株均出现特定的扩增曲线，该菌特异性融解曲线的Tm值在85.6℃－86.2℃。 * 分子生物学检测方法 检测方法研究 肺炎克雷伯氏菌灵敏度试验 添菌量为1.6CFU/100g及16CFU/100g的4个样品经增菌后检测全部为阳性，说明该方法检测低限可以达到100CFU/100g。 * 分子生物学检测方法 检测方法研究 2. 产酸克雷伯氏菌荧光PCR检测方法 引物设计： 由于产酸克雷伯氏菌具有多聚半乳糖醛酸酶，所以菌落在多聚半乳糖醛酸盐半固体琼脂平板上形成程度不同的凹陷（见图） 菌 名 菌 号 多聚半乳糖醛酸酶 PehX 产酸克雷伯氏菌 上海CDC69-88 ＋ ＋ 产酸克雷伯氏菌 ATCC49334 ＋ ＋ 产酸克雷伯氏菌 ATCC49473 ＋ ＋ 产酸克雷伯氏菌 ATCC700324 ＋ ＋ 产酸克雷伯氏菌 K.oxy5914 ＋ ＋ * ttcacggccaccaacctgcagccggatacggagtatgcctttacggtgcgcgcggtctacgccaatggccaggaatctccggacagcgcggtggttaaagcgcaaacccgcaaaacgccgcacgtcatcgaagccagcacattcggcgcgaagggtgacggcaccacgctgaatacccaggcgctg