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乙型肝炎病毒（HBV）变异及检测技术的研究进展 ————主讲人 何小周 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起乙型肝炎。 乙型肝炎是一种世界性疾病。全世界HBV感染者超过2.5亿人，且乙型肝炎病毒感染易转变慢性活动性肝炎、慢性迁移性肝炎或无症状携带者，其中部分会发展为原发性肝细胞癌（HGG）。 HBV变异研究的主要问题 变异是如何发生的 变异的类型 怎样对变异进行检测 1.1 HBV基本结构 分类：嗜肝DNA病毒科。 形态：有感染性的HBV颗粒是具有双层衣壳和核心，直径为42nm的球形颗粒，又称Dane颗粒。主要结构有： 1.2 HBV基因组结构要点 不完全环状双链DNA 全长约3.2 kb ，是目前己知的对人类致病的最小的DNA病毒 长链（L链）为负链、短链（S链）为正链。 长链为转录模板链，有4个开放读码框：S、C、P、X区。 2 HBV基因变异机理 2.1 内因：HBV本身的结构及功能特点决定其易于发生变异。 3. HBV变异的热点研究类型 基本核心启动子变异 前C区基因变异 S基因插入变异 YMDD变异株 YMDD突变株 ?? 长期的抗病毒治疗，使抗药性病毒加快增殖，成为体内的优势病毒，而此种病毒对于原有的治疗有抵抗力。药物作用的靶点越单一，则变异发生可能性越大，发生变异的速度越快。而拉米呋啶(Lamivudin，LAM)就是这样一种单靶点作用药物。在乙肝抗病毒治疗中,LAM可抑制野生型HBV的DNA,但随着拉米呋啶治疗时间的延长 ，HBV-DNA多聚酶的酪氨酸·蛋氨酸·天冬氨酸·天冬氨酸的氨基酸序列可能发生变异形成的变异株，从而影响药物的作用效果，干扰乙肝的治疗。对于持续感染的乙肝病人中尤其要注意诸如此类的耐药突变，及时改换药物，以免延误最佳治疗时期。 4. HBV变异的检测技术 4.1 DNA分子杂交技术与DNA的分子导流杂交 导流杂交法利用DNA 探究实验仪为平台,具体方法是将所有杂交液体强迫性流过点有检测探针的薄膜(通常该硝基纤维(nitrocellulose)网膜的孔径为约0.45微米, 也可用其它孔径和厚度的薄膜),让所有单链 DNA 或RNA 与膜上探针在微孔中充分接触,与固定在孔中相对应的互补单链探针产生杂交结合。这将大大提高渗透速度和反应的有效浓度,从而迅速杂交形成双链,清洗时同样以纯净的清洗液强迫性流过薄膜,完全把未结合的探针冲洗干净,因此既灵敏又快速。它能提供精确的反应条件,可达到更高灵敏度和特异性。整个杂交及清洗过程一般不超过二、三十分钟,甚至只需几分钟。 4.2 肽核酸阵列杂交检测 肽核酸 (PNA)是一种核酸类似物 ,由聚 N-(2-氨基乙基)甘氨酸替代 DNA分子中的磷酸戊糖骨架 ,四种碱基通过亚甲基羰基与骨架相连。它为非手性分子、不带电荷,稳定性高、不易被蛋白酶和核酸酶所降解、在很宽的 pH值范围内稳定,与核酸的结合遵循Waston-Crick碱基互补配对原则。由于 PNA含中性骨架 ,链间无排斥作用,它与DNA、RNA所形成的杂交体热稳定性要比相应的 RNA-RNA、DNA-DNA、 DNA-RNA 高。PNA 的结合特异性也要高于DNA和RNA。同时PNA的杂交不依赖高盐离子强度,只需低的盐离子强度。考虑到 PNA的配对、结合和杂交等特性,PNA探针在识别单碱基突变、 在微阵列和生物传感器方面具有广阔的前景。 并且已用于HBV变异的检测，前景令人乐观 4.3 YMDD基因变异的检测方法 拉米夫定治疗乙肝6个月以上就会产生耐药性,这与HB-YMDD基序变异有关。目前检测YMDD变异的检测技术主要有直接测序法、限制性片断多态性分析(RFLP)、5’一核酸酶检测法、基因芯片法、实时定量PCR、焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术、高效变性液相色谱法(DHPLC)等。这些方法各有利弊,并且有些弊端暂时还没有较好的解决方法。 4.4 基因芯片技术 结束语 HBV的变异可以在其感染慢性化的过程中自然发生 ,但也可在人体的免疫应答或疫苗接种等免疫压力下产生 ,或在抗病毒药物治疗压力下诱发 ,藉以逃避机体免疫系统和药物的攻击 ,并在此过程中进行变异的优势选择。近来的研究表明 ,宿主的免疫压力对 HBV基因突变的产生和选择起了重要作用。 总之,HBV变异后对乙肝诊断、治疗、预防等都产生重大影响,必须指出的是, 在HBV持续感染中的各种突变不是孤立的 ,而是有多种时间以及空间的组合的。因而对待HBV变异必须从全基因组出发、从各个角度全方位考虑、运用多种检