测定样品含糖量计算100克小麦面粉中总糖含量二氨基酸的分离鉴定.ppt

生物化学实验 任课教师：李遂焰 实验一 总糖的测定——蒽酮比色法 实验要求 掌握蒽酮比色定糖法的原理和方法 掌握72型分光光度计的原理和操作方法 学习通过制作标准曲线测定未知物含量的方法 实验原理 糖类在较高温度下经浓无机酸作用脱水产生糠醛或糠醛衍生物，可与蒽酮缩合成蓝绿色化合物，颜色深浅与糖量成正比。 本法多用于测定糖原含量，也可用于测定葡萄糖含量。 实验内容与结果 1、制作葡萄糖标准曲线 2、测定样品含糖量 计算100克小麦面粉中总糖含量 实验二 氨基酸的分离鉴定——纸层析法 实验要求 学习分配层析法的原理 掌握氨基酸纸上层析的操作技术（包括点样、平衡、展层、显色及鉴定） 实验原理 纸层析法是以滤纸作支持物，纸纤维上的羟基具有亲水性，能吸附一层水作固定相，而与水不相混合的有机溶剂作流动相，因此利用分配层析原理，不同物质在两相间有不同的分配系数而在纸上移动的距离不同，即被分开。 本实验分离的是混合氨基酸样品，层析之后用茚三酮试剂显色。 实验内容与结果 1、点样 2、展层 3、显色 用铅笔描出显色斑点的形状，测其距离并计算各氨基酸的Rf 值。 实验三 蛋白质的等电点测定及沉淀反应 实验要求 了解蛋白质的两性解离性质 学习测定蛋白质等电点的一种方法 通过实验加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 区分可逆沉淀反应及不可逆沉淀反应并了解其实用意义 了解蛋白质变性及沉淀的关系 一、蛋白质的等电点测定 原理： 蛋白质是两性电解质，其解离状态和程度受溶液的酸碱度影响。在等电点（pI）时，蛋白质的理化性质有变化，可利用性质的变化测定蛋白质pI。常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。 操作： 用醋酸和醋酸钠配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。 二、蛋白质的沉淀反应 原理： 蛋白质是一类高分子化合物，分子大小已达胶体颗粒范围（1~100毫微米）,因此蛋白质在水溶液中具有胶体的性质。维持蛋白质胶体稳定的因素有两个：一是胶体颗粒所带的电荷，一是与介质水形成的水化膜。这种稳定性是有条件的、相对的，在一定物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的沉淀反应。 蛋白质的沉淀反应可分为两类： 1）可逆沉淀反应：如盐析作用，等电点沉淀蛋白质等。提纯蛋白质时，常用此类反应。 2）不可逆沉淀反应：如重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀而析出。 操作 1．蛋白质的盐析作用 2．重金属沉淀蛋白质 3．有机酸沉淀蛋白质 4．有机溶剂沉淀蛋白质 5．生物碱试剂沉淀蛋白质 实验四 血清γ—球蛋白的分离、纯化及鉴定 实验要求 初步学会分离、纯化蛋白质的常用方法并了解其原理。 学习盐析、层析基本原理及实验技术。 掌握电泳基本原理，熟悉操作方法，了解影响电泳的因素。 实验原理 （一）血清γ—球蛋白的分离 血清蛋白质先用盐析初步分离。半饱和硫酸铵可沉淀血清球蛋白而白蛋白不被沉淀，离心后白蛋白主要集中在上清液中，而球蛋白主要在沉淀中。将球蛋白沉淀溶于少量水中，装于透析袋，透析除去硫酸铵。脱盐后的蛋白质溶液，在0.0175摩尔/升pH6.3磷酸缓冲液条件下加到DEAE—纤维素柱上，在此pH下，DEAE—纤维素带正电荷，能吸附带负电荷的白蛋白、α-及β-球蛋白，仅γ—球蛋白不能吸附而直接流出。 (二) 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳 利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺单体和少量交联剂在催化剂、加速剂的作用下发生聚合反应而制得的，利用电泳和分子筛的双重作用分离物质，分辨力较高。血清蛋白在纸上电泳可分为5~7个组分，而在聚丙烯酰胺电泳上可分出12~25个组分。 实验内容 （一） 血清γ—球蛋白的分离纯化 1．硫酸铵盐析 ：注意应缓慢滴入饱和硫酸铵溶液并边加边摇，避免局部浓度过高。 2．透析脱盐：用纳氏试剂检查水中NH4+，直至硫酸铵全部透析完毕。 3．DEAE—纤维素柱层析：装柱、平衡柱床、上样、洗脱收集。 4．检查洗脱液中蛋白质：磺基水杨酸检查，出现白色沉淀即有蛋白质析出。合并蛋白质含量高的洗脱液，以备鉴定。 （二） 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶垂直板状电泳 1．凝胶板的制备：板状电泳槽按要求夹好、固定，用1%琼脂封边，并按比例配制凝胶，灌入凝胶板。 2．样品的准备：样品中加入样品稀释液，内含溴酚兰为示踪染料。 3．电泳：将上电泳槽的电极接电泳仪的负极，下电泳槽接正极，调节电压为150伏，电泳约1小时。 4．剥胶 5．固定、染色、脱色 实 验 结 果 将分离纯化的蛋白质收集，经电泳分