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核酸分析技术及其应用

第四章 核酸分析技术及其应用 一.质粒 二.染色体DNA 三.分子杂交的概念与应用 四.分子杂交技术 五.常用的生化技术 一、质粒 (一)概述 (二)质粒的提取方法 (一)概述 定义:质粒是细菌染色体外具有遗传功能的闭环双链DNA。 质粒具有自主复制能力,在细菌分裂时可伴随细菌染色体分配到子细胞并在细菌的后代中存续。 质粒DNA上具有某些可指令寄主菌产生某些特殊功能的蛋白质,因而赋予细菌不同的特性,诸如致育性(F及P质粒)、耐药性(R质粒)、抗原性(ST、LT的Ent质粒)及多种的生化反应特性(分解乳糖,H2S产生、柠檬酸盐的利用。 (一)概述(续) 有些质粒具有传递基因(tra),它们能通过菌细胞之间的接合作用在种内或种属之间发生接合性传递,称为接合传递性质粒。 有些质粒缺乏tra基因组,或tra基因组受到可转位成分的插入而钝化,称为非接合传递性质粒,该质粒有些可诱动到受体菌的染色体中。 质粒也可以通过噬菌体的转导或质粒DNA转化进行传递。 质粒可整合(或暂时性)到染色体上引起细菌种属间基因交换,称为cma(诱动染色体活性)。 (一)概述(续) 大多数细菌均含有大小不一、数目多寡不等的质粒。细菌可带一种或几种质粒(V517可带8个大小不等质粒),其生物学功能不清楚,在一定时期,在有限的空间中,细菌携带的质粒是相对稳定的。因此某一菌株所带的质粒,构成了该菌株的一个重要特征,供鉴别、分析、研究。 质粒在各个不同领域的研究进展 1.流行病学方面: (1)传染源及传播途径追踪。 1)分析传染源:用质粒图谱和质粒酶切图谱分析两起出血性肠炎的流行,结果两地区菌株带质粒大小相似,但酶切图谱不同,因而可认为两地区分离菌株有关,但不同源。 2)分析传播途径:在某一次军团热的医院感染中,用质粒酶切图谱法证实了热水罐是该次感染的来源。 (2)疾病监测: 质粒在各个不同领域的研究进展(续) 2.对细菌毒力、致病性的研究 (1)痢疾:证明其毒力是与携带大小不等的质粒(180~210kb)有关。 (2)大肠杆菌:可带有肠毒素质粒LT、ST或LT+ST。与侵袭力有关的ColV质粒、α-溶血素质粒。与定居有关的K88、K99、CFA/I、CFA/II等质粒。 (3)小肠结肠炎耶尔森氏菌侵袭性与41Mdal质粒有关;鼠疫杆菌及假结核杆菌中44.4~46Mdal(pSB2)质粒有关。 (4)金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的结构基因在染色体上而质粒pSN2在SEB合成中起调节功能。 质粒在各个不同领域的研究进展(续) 3.基因工程载体 质粒在不同遗传背景的寄主菌内或受到外界因素的作用或由于可转位成分(插入序列与转座子)的插入发生变异,因此质粒既可作为体外基因工程载体又可为体内遗传工程所用。它是DNA重组技术所以能迅速发展起来的一个重要支柱。 (二)质粒提取的方法 质粒DNA的制备主要包括三个基本步骤: 第一步:细菌培养和质粒的扩增。 收集细胞原材料中质粒DNA含量,取决于活菌数和每个细菌中质粒的拷贝数。当细菌培养至OD600=0.6~1.0,即细菌处于对数生长后期(核酸复制的高峰期)是DNA提取的最佳状态。若要得到更多的细菌培养液,在培养物OD600=0.4~0.6时逐步加入新鲜培养液。一般在细菌培养到对数生长后期时,在培养液中加入蛋白质合成阻断剂(氯霉素),染色体复制停止,质粒独立复制,其拷贝数可高达100倍。 (二)质粒提取的方法(续) 集菌过程: (1)平皿上取单个菌落种于5~10mlLB肉汤培养基中37℃静置过夜; (2)取1ml上述培养物转种于50ml新鲜培养基中(如有抗药标记,加入适量的抗菌素),37℃振摇2~3h,OD600=0.4~0.6,再加入50ml新鲜培养基37℃振摇至OD600=0.7~0.8; (3)加氯霉素液(终浓度为0.17mg~0.2mg/ml,扩增12~16h) (4)4℃6000rpm离心5~10min,弃上清,沉淀重悬于25mlTE液,混匀后, 4℃6000rpm离心5~10min。 (二)质粒提取的方法(续) 第二步:制备含质粒DNA的细菌裂解液。 在温和裂解条件下细菌胞壁和胞膜受到破坏,形成许多小裂口,分子量小的质粒DNA及RNA,随细胞质一起释入裂解液中,分子量大的DNA,不易释出,而形成细菌残体—染色体复合物,经高速离心,形成沉淀去除裂解剂:溶菌酶、SDS、TritonX-100等。 第三步:质粒DNA 的纯化。 方法有:利用质粒于染色体构型差异,经高速离心而分离纯化;用蛋白质变性剂(酚、氯仿)或蛋白酶去除蛋白质杂质而纯化质粒DNA ;用Raase去除RNA;还可利用质粒DNA、染色体DNA和RNA分子量差别及可变性、沉淀不同等,建立许多柱层析纯化质粒DNA 。 二.染色体D

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