分子生物学绝对重点.doc

基因克隆的一般步骤： 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。 原核基因调控机制的类型与特点 可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类： 可诱导调节：一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。（例：大肠杆菌的乳糖操纵子、分解代谢蛋白的基因） 可阻遏调节：基因平时是开启的，在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。（例：色氨酸操纵子、合成代谢蛋白的基因） 基因对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白）的应答，可分为：正转录调控、 负转录调控 在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白，根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导系统和正控阻遏系统。 在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态； 在正控阻遏系统中，效应物分子（辅阻遏蛋物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。 在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白，起着阻止结构基因转录的作用。阻遏蛋白作用的部位是操纵区。根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏。 在负控诱导系统中，阻遏蛋白不与效应物（诱导物）结合时，结构基因不转录； 在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。 乳糖操纵子构成及机制 组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O，一个启动子P和一个调节基因I。乳糖操纵子同时受正性调节和负性调节。 机制：①阻遏蛋白的负性调节：没有诱导物存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有诱导物存在时，诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。②CAP的正性调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。 因此，乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约 色氨酸操纵子与负控阻遏系统 结构：色氨酸操纵子中的结构基因区是由trpE、trpD、trpC、trpB、trpA基因构成，紧邻trpE基因的是启动子区（P）、操纵区（O）、前导区（L）和弱化子区（a）。色氨酸操纵子中编码辅阻遏蛋白的基因是trpR，距色氨酸基因簇很远 阻遏系统-粗调： 色氨酸操纵子的效应物是色氨酸，当培养基中色氨酸含量较高时，它与辅阻遏蛋白结合后，结合到操纵区，阻止转录；当培养基中色氨酸供应不足时，辅阻遏蛋白不结合色氨酸，从操纵区解离，色氨酸操纵子启动转录。这种调节相当于色氨酸操纵子的粗调开关 弱化作用-细调 ：在前导肽的第10位和第11位上有相邻的两个色氨酸密码子。通过前导肽基因的翻译来调节色氨酸操纵子转录的终止。因为在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对色氨酰-tRNA的浓度敏感。 分子克隆载体：是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。 (１)功能:a.运送外源基因高效转入受体细胞;b.为外源基因提供复制能力;c.为外源基因的扩增提供必要的条件; (２)特点:a.至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制;b.至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入;c.至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞; (3)类型:a、质粒载体（主要讲述） 用途：检测DNA样品中的基因及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。 操作步骤：DNA→琼脂糖电泳→印迹转移 → 杂交（变性探针）→洗膜→放射自显影或显色 2 Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测RNA样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含