PLFA 测定操作规程.doc

PLFA测定操作规程 仪器设备： 名 称 规 格 数 量 用 途 烘箱 ** 1 测定土壤含水量 冷柜 4℃ 1 暂存土壤样品 冷柜 -20℃ 1 用于土壤样品的长期保存 及2-3天内待检测样品的保存 冷柜 -80℃ 1 保存3天以上的待检测样品 通风橱 中 1 试验各步骤均需在通风橱中进行 分析天平 1/10000 1 称样及测定含水量 振荡器 可调速 1 提取 超速离心机 最高转速〉5000r/min 1 提取 氮吹仪 DC-12 1 浓缩提取液 萃取收集器 12孔SUPELCO VISIPREPTM DL 1 纯化（获取PLFA） 真空泵 10-30Pa 25L/min 1 加速淋洗速度 水浴锅 恒温 1 甲醇分解 微量加样枪 200ul 1 移液 微量加样枪 500ul 1 移液 微量加样枪 1000ul 1 移液 微量加样枪 5000ul 1 移液 移液瓶 6ml 1 移液 移液瓶 12ml 2 移液 移液瓶 23ml 1 移液 实验耗材: 名 称 规 格 数 量 用 途 铝盒 中号 24 测定含水量 离心管 50ml 24 提取 分液漏斗 250ml 24 萃取样品溶液的酯类物质 大试管A 35ml 24 盛装分液漏斗分离的总酯提取液 大试管B 10ml 24 盛装经萃取小柱分离的PLFA甲醇溶液 大试管C 5ml 24 盛装甲醇分解后的PLFA甲酯溶液 萃取小柱 3ml or 6ml 24 纯化PLFA 枪头 5ml 10 移液 枪头 1ml 5 移液 枪头 500ul 30 移液 枪头 200ul 60 移液 丙腈橡胶手套 中号 2 实验操作时须戴 橡胶手套 厚 2 清洗容器时须戴 纱布 卷 1 罩容器试剂瓶时用 注：数量以24个样品计。 实验试剂（以24个样品计）： 名 称 规 格 最 低 用 量 正己烷 分析纯 120ml 三氯甲烷 分析纯 840ml 甲醇 优级纯 720ml 丙酮 优级纯 240ml 甲苯 优级纯 12ml 氢氧化钾 优级纯 24ml 0.2M KOH 醋酸 优级纯 7.2ml 1M CH3COOH 磷酸 优级纯 530ml 超纯水 48ml 注：未计清洗用量和配试剂用量。 试 剂: 1、磷酸缓冲液[c(K2HPO4) = 0.05 mol·L-1]：38.84 g K2HPO4加入12ml CHCL3再加入超纯水稀释到4000； 2、提取液[v（甲醇）：v（三氯甲烷）：v（磷酸缓冲液）= 2：1：0.8]：526 ml CH3OH加入263 ml CHCL3再加入210 ml 磷酸缓冲液； 3、甲醇甲苯混合液[v（甲醇）：v（甲苯）：=1：1]：取100 ml 甲醇和100 ml 甲苯混合； 4、甲基化醋酸[c(CH3COOH) =1 mol·L-1]：4.60 ml CH3COOH加入80 ml 超纯水； 5、甲基化氢氧化钾[c(KOH) =0.2 mol·L-1]：28.05 g KOH溶解于1000 ml 超纯水 中为0.5M KOH溶液，再取40 ml 0.5 M KOH溶液加入60 ml CH3OH为0.2M KOH溶液。 PLFA提取操作流程： 实验前准备工作 1、土壤过2 mm 筛，用镊子捡出根、凋落物碎屑及小石块； 2、20克左右土壤样品置于铝盒中，称盒+鲜土重 105烘干，称盒+ 干土重 计算土壤含水量； 3、配制试剂，准备实验用品。 注意：所有玻璃器皿（试管、小瓶及瓶盖等）在实验前均须用正己烷清洗，晾干。 实验操作时必须戴丙腈橡胶手套。 称取相当于8g干重的土壤，置于35ml 离心管中 向离心管中加入5ml 磷酸缓冲液（用5ml 移液枪，将含水量计入）， 再加入6ml 三氯甲烷，12ml 甲醇（用移液瓶） 25℃，3500 rpm, 离心10分钟 加入23ml 提取液于离心管中的剩余土壤中，手工摇动 振荡30分钟 25℃，3500 rpm, 离心10分钟 将分液漏斗中下层溶液放入大试管A中