副溶血弧菌检验标准方法免疫荧光法.docVIP

`前 言 本标准适用于食品中嗜盐性海洋弧菌---副溶血性弧菌的免疫荧光镜检快速筛查法。 本标准编制按GB/T 1《标准化工作导则》和GB/T 20001《标准编写规则》进行。 本标准由连云港市产品质量监督检验所提出。 本标准由连云港市产品质量监督检验所负责起草。 本标准主要起草人： 周翔 本标准于2010年8月首次发布。食品中副溶血性弧菌免疫荧光镜检快速筛查法 范围 本标准规定了食品中嗜盐性副溶血性弧菌的免疫荧光快速筛查检验方法。 本标准适用于海洋水产品和淡水水产品及加工的含盐其它食品。 本标准检出限为 10 CFU/g 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 20001.4-2001 标准编写规定 实验原理? ?? ? 荧光抗体染色是显微镜标本上的抗原—抗体反应。必须制成镜检标本。作为检测抗原目的标本片，细菌检样作成单层。夹心法，即用未标记的特异性抗原加在片上先与中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出中抗体的存在　设备3.1? 拍打式均质器。3.2? 电动试管振荡器。3.3 低温高速冷冻离心机（25000r/min） 3.4 全自动加液器（10~1000μl）　 3.5 天平（0.1g） 3.6 直落式荧光显微镜 3.7? 水套式培养箱 3.8? 冰箱（0~8℃） 3.9 湿盒 3.10 20ml一次性注射器 3.11 无荧光盖玻片 3.12 无荧光载玻片 3.13 洗片缸 3.14 标本缸（存放实验片待灭菌） 3.15 高压灭菌器 4　试剂4.1? 副溶血型弧菌羊抗血清4.2? 兔抗羊荧光抗血清 4.3 甲醇 4.4 无荧光丙三醇（甘油） 4.5　? 4.6　4.7　无荧光甘油9份，pH7.2 PBS 1份　样品制备?5.1　 冷冻样品应在45以下不超过15min或在2～5不超过18?h解冻。若不能及时检 验,?应放于5左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于6～10冰箱保存,在24?h内检验。5.2　 取样:以无菌操作进行。?5.2.1?鱼类:取鱼体不同部位。5.2.2贝类:取内脏或含内脏的全部贝肉；如为带壳贝类,则应先在清洁的流水中洗刷净外壳,然后以无菌操作打开贝壳,取出内脏或含内脏的全部贝肉和贝液。5.2.4甲壳类:取包括鳃及肠的部分或整体。—TWEEN80中均质拍打20分钟，1500r/min,10min,离心，吸取上清液到第二个离心管中。加入5ml有机试剂，2000r/min，10min。吸取上清水相液到第三个离心管，6000r/min,20分钟。倾去溶液，将沉淀用5ml无菌水洗涤悬浮后离心3次备用。 实 验 流 程 6实验方法 6.1间接染色法 6.1.1 本自发荧光对照：已知抗原标本加1-2滴PBS或不加，应无荧光出现。 抗原对照：已知抗原加正常同种动物标记球蛋白溶液染色，应无荧光。 阻抑试验：标本滴加同种未标记抗体感作30min后，再加标记抗体，镜检应无荧光现象。 种属抗原染色：标记抗体与种属抗原标本染色，应无荧光出现。 阳性对照：标记抗体与已知抗原染色，应呈强荧光反应。对照染色可根据条件适当选择。 标本经固定后，于被检标本上滴加已知未标记的抗体（或抗原）置湿盒37℃30min。 先以pH7.2 PBS冲洗，然后浸泡于三缸PBS中，每缸3min并注意振荡。 弃掉PBS，用吸水纸吸干。 滴加荧光，置湿盒37℃感作30min。 以PBS浸洗3次，最后用蒸馏水洗1次， 滴加缓冲甘油封片镜检 Q/320306XAQ01-2002 Q/320306XAQ01-2002 1 DB32/T -2010 DB32/T -2010 2 I 2 3 B66 江苏省地方标准 DB32/TQ DB32/T -2010 发 食品中副溶血性弧菌 免疫荧光镜检快速筛查法  2010- 08 -01发布 2010-08-01 实施 连云港市产品质量监督检验所 发布 样品25g（ml）+75ml 0.45%生理盐水，