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Western blot protocol
第一部分:样品制备
(一)、所需试剂:
1. Western 及IP 细胞裂解液(KGP701) :Western 及IP 细胞裂解液分装后存于
-20 ℃冰箱中,避免反复冻融;
2. PMSF (100mM):sigma;
3. PBS
(二)、所需耗材:
离心管、细胞刮、各种规格的枪头
(三)、所需仪器:
各种量程的移液器、4 ℃高速离心机
(四)、操作步骤:
1.在每mL 冷Western 及IP 细胞裂解液加入10μL 100mM PMSF,混匀。冰上
保存数分钟待用;
2. 倒掉已处理好的细胞的培养液,预冷的PBS 冲洗两次,每次振摇数次以尽量
去除培养液,将培养瓶置于冰上;
7 个细胞加入Western 及
3. 加入上述适量配制好的Western 及IP 细胞裂解液(10
IP 细胞裂解液1 mL~2 mL ),用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触;
4. 裂解完毕后,迅速用细胞刮将细胞刮于培养瓶一侧(动作须块),然后用枪将
细胞碎片和裂解液转移至1.5ml EP 管中(操作在冰上进行),10000 转/分,4 ℃
离心5 min (离心机需要预冷);
5. 取上清转移至新的预冷的离心管中,蛋白定量(BCA 法);
第二部分:测定蛋白浓度
(一)、所需试剂:
凯基BCA 蛋白含量检测试剂盒(KGPBCA ),分装后存于-20 ℃冰箱中,避
免反复冻融。
(二)、所需耗材:
Ep 管、96 孔板、离心管、细胞刮、各种规格的枪头
1
(三)、所需仪器:
各种量程的移液器、振荡器、37℃烤箱、酶标仪
(四)、操作步骤:
1. 根据样品数量,按50 体积BCA 试剂A 加 1 体积BCA 试剂B(50:1)配制适量
BCA 工作液,充分混匀;
2. 取一块96 孔板,按照下表加入试剂:
孔号 0 1 2 3 4 5 6 7 样品1
蛋白标准溶液(μL) 0 1 2 4 8 12 16 20
去离子水(μL) 20 19 18 16 12 8 4 0 19
样品 1
对应蛋白含量(μg ) 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0
BCA 工作液 (μL) 200 200 200 200 200 200 200 200 200
3. 把96 孔板放在振荡器上振荡30sec,37℃放置30min,然后在562nm 下比色
测定。以蛋白含量(μg )为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线;
4. 稀释待测样品至合适浓度,使样品稀释液总体积为20μL,以标准曲线0 号管
做参比,在562nm 波长下比色,记录吸光值;
5. 根据标准曲线计算样品实际浓度 (单位:μg/μl ),将所有样品浓度用裂解液调
至4μg/μl ;
6. 分装保存于-80℃,避免反复冻融。
第三部分:Western bloting
(一)、所需试剂:
1. 30%丙烯酰胺溶液:丙烯酰胺29.2g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加水至100ml,
棕色瓶4 ℃保存。
2. 1.5mol/L Tris-HCl 分离胶缓冲液pH8.8(4x) :取18.15g Tris,用1N HCl 调pH
至8.8,加水至100ml,4 ℃保存。
3. 1mol/L Tris-HCl 分离胶缓冲液pH6.8(4x) :取12.114g Tris,用1N HCl 调pH
至6.8,加水至100ml,4 ℃保存。
4. 电泳缓冲液 (pH8.3) :取14.49g 甘氨酸,3.02g Tris,1g SDS or 100ml 10% SDS,
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