肌肉特殊染色.docVIP

肌肉冰冻切片常用组织学及组织化学染色技术 ?（—）苏木精和伊红染色（Hematoxylin and Eosin, HE） 苏木精溶液染色10分钟 2．流水冲洗10分钟? 伊红溶液染色3分钟 4．流水冲洗1分钟 ?? 5．脱水，透明树胶封固?? 骨骼肌HE染色（肌膜核蓝色，肌纤维粉红色，结缔组织淡红色） （二）改良Gomori三色染色方法（Modified Gomori Trichrome, MGT） Harris苏木精10分钟 水冲洗 10分钟 Gomori氏溶液30分钟 ～4．0．2%醋酸浸洗分钟 5．酒精脱水，二甲苯透明，树胶封固。 骨骼肌MGT染色（核紫红,肌纤维暗绿色,胶原亮绿色 ,线粒体红色） （）PAS反应法(Periodic? Acid?? Schiffs? reaction,? PAS) 固定于Carnoiy氏固定液10分钟 2．流水冲洗2分钟 3．0．5%过碘酸5分钟 4．蒸溜水洗1～2分钟 5．Schiff氏溶液15～30分钟 6．流水洗5～10分钟 7．Harris苏木精溶液2分钟 8．流水洗5分 9．脱水、透明、封固（合成树胶）? 骨骼肌PAS染色糖原红色，肌内肌原纤维用清晰可见ⅡA纤维染色反应强，ⅡB、ⅡC、Ⅰ型纤维呈中间型。 20分钟（加盖防气化） 2．? 流水洗 过滤的苏木精染1分钟 4．? 流水洗2分钟 5．? 甘油明胶封固 结果：脂类物质染成黑色，。 （五）四氮唑还原酶(NADH—tetrarolium redutase, ?NADH—TR )孵育于下列基质内30分钟，37℃? 0.05M（或0.2M）Tric缓冲液（PH7.4）? 30ml?硝基四氮唑（BNT）30mgNADH 24mg 蒸馏水洗。 . 甘油明胶封固。?? 骨骼肌NADH－TR染色(Ⅰ型肌纤维紫兰色，Ⅱ型肌纤维淡灰色)。（）琥铂酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，SDH） 染色步骤 1．孵育于下列基质30分钟,37℃? 琥泊酸钠100 mg? 硝基四氮唑兰 10 mg? 吩嗪二甲脂硫酸盐0.3 mg? 0.1M Tris缓冲液30ml? 调PH7.2 2．顺序在60%、90%、60%丙酮顺序脱水及蒸馏水清洗 3．甘油明胶封固。?? 骨骼肌SDH染色（Ⅰ型纤维色深，ⅡA、ⅡC中间型，ⅡB染色浅）（） 细胞色素氧化酶染色（COX） 1．? 下述基质内孵育1～4小时 37 DAB（3， -3，-二氨基联苯二氨盐酸盐）?mg 0．1M醋酸缓冲液???????????????????? .0ml 1%氯化锰???????????????????????????? ml 0．1%新鲜过氧化氢??????????????????? 0.ml 2．? 蒸馏水冲洗 3．? %硫酸铜冲洗5分钟 4．? 蒸馏水冲洗 5．? 甘油封固 肌纤维呈褐红色，代表线粒体反应，细胞色素氧化酶缺陷时则无色。（）腺苷三磷酸酶(Adenosine? Triphosphatase, ATPase) ?1.制备下述溶液： A）碱性溶液： 0.1M 巴比妥钠 1份体积 ????????????? 0.18M CaCl2 1份体积 ????????????? 蒸馏水 3份体积 ????????????? 调PH 9.7-11.0 B）主要孵育液及上清液： ????????????? 0.1M 巴比妥钠 2份体积 ????????????? 0.18M CaCl2 1份体积 ????????????? 蒸馏水 7份体积 ? 上述溶液分成二份即B（-）与B（+），B（-）为上清液，B（+）液为孵育液，即将B液20ml+ATP-Na:50mg调PH9.7。 C）酸性反应液： ?????? ???????0.2M-巴比妥醋酸缓冲液 ????????????? 0.2M-巴比妥醋酸盐溶液 5份体积 ????????????? 0.1M HCL 10份体积 ????????????? 蒸馏水 8份体积 ????????????? 调PH 4.2-4.6 2．碱性PH染色片置于A液15分钟 3．10分钟后将酸性PH染色片置C液内5分钟 4．取出 5．全部切片置于B（+）溶液内45分钟 6．制备下述溶液 ?? 1%? CaCl2 2g/200ml ?? 2%CoCl2? 1g/50ml ?? 0.01M- 巴比妥钠溶液 1000ml 7． 1%? Cacl2溶液内洗三次10分钟. 8． 2%Cocl2 溶液内3分钟 9．流水洗? 10．.01M-巴比妥钠溶液内洗8次? 11．1%黄色硫化铵30秒 12．流水洗15分钟 13．脱水、