氨基酸的荧光光谱测定(验证性实验).docVIP

氨基酸的荧光光谱测定 一、实验目的 1. 了解荧光分析法的基本原理 2. 学会荧光光谱仪的操作 3. 通过实验了解荧光分析法的定性定量分析应用。 二、实验原理 荧光是分子从激发态的最低振动能级回到原来基态时发射的光。利用物质被光照射后产生的荧光辐射对该物质进行定性分析和定量分析的方法，称为荧光分析。 在一定光源强度下，若保持激发波长λex不变，扫描得到的荧光强度与发射波长λem的关系曲线，称为荧光发射光谱；反之，保持λem不变，扫描得到的荧光强度与λex的关系曲线，则称为荧光激发光谱。 在一定条件下，荧光强度与物质浓度成正比，即F=KC这是荧光定量的基础。以荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，在相同的条件下，测样品的荧光强度，从标准曲线上求出含量。 恒波长同步荧光分析法是在同时扫描过程中使激发波长（λem）和发射波长保持固定波长间隔（△λ=λem—λex=常数）。酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中仅有的能发射荧光的组分，可以用荧光分析法测定。它们的激发光谱和发射光谱有互相重叠的现象。同步扫描荧光光谱技术可以简化、窄化光谱，减小光谱的重叠性，减小散射光影响，提高选择性。 三、仪器与试剂 1. LS-55型荧光光谱仪； 2. 移液管 、容量瓶、烧杯； 3. 氨基酸储备液：色氨酸4μg/mL ：准确称取0.004g色氨酸，溶于少量水中，超声20分种，至完全溶解，移至100mL容量瓶中用水定容,低温保存。使用时稀释10倍。 苯丙氨酸100μg/mL：准确称取0.01g苯丙氨酸，溶于少量水中，超声15分钟，至完全溶解，移入100mL溶量瓶中用水定容。低温保存。 4. 去离子水 四、实验内容与步骤 1. 色氨酸标准溶液的配制：取4个50mL容量瓶，以次加入0.5, 1.0,1.5, 2.0mL4μg/mL使用溶液，加去离水定容至刻度，此色氨酸浓度为0.04 , 0.08, 0.12 , 0.16μg/mL 。 苯丙氨酸溶液的配制：取5mL苯丙氨酸储备液于50mL容量瓶中，加去离子水，即为10μg/mL。 2. 打开电脑和光谱仪主机，仪器自动校验约10分钟。设定仪器参数，分别对两种氨基酸溶液测量它们的光谱图。 2．1扫描激发光谱与发射光谱： 以下为光谱扫描参数： 波长范围 (nm) λex (nm) λem (nm) EXSlit (nm) EmSlit (nm) Speed (nm/min) 色氨酸 （Trp） 200~330 280~420 215 360 10.0 7.0 1000 苯丙氨酸（Phe） 200~350 250~360 206 287 10.0 5.5 1000 将0.12μg/mL色氨酸溶液移入荧光池内至2/3体积，放入仪器样品室，依据荧光强度值调节仪器的灵敏度等各项参数，测定其激发光谱与荧光光谱，记录信息。（记住取文件名） 2．2 荧光强度与浓度的关系 在同样的仪器条件下依次按如下顺序测定不同浓度的色氨酸溶液荧光光谱：0.04, 0.08 , 0.12 ,0.16μg/mL。记录荧光强度值。 2．3同步荧光光谱 依据0.12μg/mL色氨酸溶液的荧光强度值重新调节仪器参数： 波长范围 (nm) △λ（λem—λex） EXSlit (nm) EmSlit (nm) Speed (nm/min) 色氨酸 （Trp） 200~350 145 10.0 7.0 1000 苯丙氨酸（Phe） 200~300 81 10.0 5.5 1000 （注意：由于物质的荧光性质受许多条件的影响，以上实验参数仅供参考，具体参数的选择视实际情况而定。） 五、数据处理 1. 用实验获得的数据绘制两种氨基酸的激发、发射、同步光谱图。（两种氨基酸光谱图各打印于同一张图纸上。） 2. 由系列标准色氨酸溶液的荧光光谱，以最大发射波长荧光强度对溶液浓度作标准曲线回归方程式及相关系数。（荧光光谱重叠打印于同一张图纸上。） 3. 从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应的峰高。在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高。 六、讨论与思考 1. 比较不同浓度色氨酸溶液荧光光谱的形状。确认色氨酸溶液浓度增加时荧光光谱的变化规律，解释原因。 2. 观察色氨酸激发波长曲线250—300nm处出现一个峰,苯丙氨酸激发波长曲线在240—300nm处出现二个吸收峰，它们属于什么峰，该波长产生荧光光谱是否适合进行定量分析？ 3. 同步荧光技术有哪些优点？比较激发、发射和同步荧光光谱中的峰值及对应波长，比较它们的不同，并解释原因。 实验室：分析中心