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第11章 微生物学新技术在环境工程中的应用 随着工业化进程的加快，人们生活水平的迅速提高，污染物的种类和数量迅速增加，而许多污染物不易被现存的微生物分解，或无法被微生物快速安全地降解，造成了严重的环境污染。 微生物学新技术为污染问题的解决提供了广阔的前景 。 微生物学新技术包括遗传诱变育种、基因工程、酶工程、生物表面活性剂、微生物制剂等。 在环境工程中的应用越来越广泛。 第一节 遗传工程与环境保护 一、质粒育种 质粒是存在与染色体外的遗传物质； 降解性质粒存在于某些微生物中，1970年代微生物学家首先发现了恶臭假单胞菌R1具有降解水杨酸特性的质粒，编码降解水杨酸的酶系。随后，人们逐渐发现了降解脂肪烃、芳香烃、多环芳香烃、氯代芳烃、生物碱和多氯联苯的降解性质粒。 已发现和研究的部分降解性质粒 降解性质粒可使宿主细胞具有降解某种特殊物质的能力，作为宿主细胞的碳源物质。 如有些假单胞菌和蜡状芽孢杆菌能使二氯苯完全分解； 某些产碱杆菌和假单胞菌能以二氯苯、1,2-二氯苯、1,3-二氯苯、1,4-二氯苯作为唯一碳源。 利用质粒的特殊性状和质粒的转移特性可以培育优良菌种。 质粒育种是将两种或多种微生物通过细胞结合或融合技术，使供体菌的质粒转移到受体菌内，受体菌既保留有自身功能的质粒，同时又获得供体菌的功能质粒，由此培育出具有两种或多种功能质粒的新菌株 1) 构建多功能基因工程菌 海上原油泄漏是常见事故，为了快速消除泄漏的原油，有人把降解芳烃、萜烃、多环芳烃的CAMOCT、NAH、TOL质粒通过接合，转移到能降解脂烃的假单胞菌体内，得到了能同时降解多种烃类的超级菌。 它能在几小时内把60%的原油分解，迅速消除海上泄漏原油的污染。 有人分别用含有降解偶氮染料质粒的KN和K46两株假单胞菌通过质粒转移技术培育出了兼有分解两种偶氮染料功能的脱色工程菌。 Chakrabarty等人将嗜油假单胞菌体内有降解辛烷、乙烷、癸烷功能的OCT质粒和抗汞质粒MER同时转移到对20mg/L汞敏感的恶臭假单胞菌体内，这株菌既能高效分解辛烷，同时又能抵抗50-70mg/L汞。 2）质粒分子育种 是在恒化器长期混合培养过程中，增加选择压力，通过各种微生物间质粒的自然传递和相互作用，实现降解性质粒的自然转移，从而大大缩短了自然进化的进程，实现了加速培育新菌株的目的。 除草剂2, 4, 5-T（2,4,5三氯苯氧乙酸）化学结构稳定，很难从自然界分理出以2,4,5-T为唯一碳源的菌株； Chakrabarty等人从堆放有毒废物垃圾的地方采集样品，分离菌种并将其接种至恒化培养器中，与带有CAM、SAL、TOL、pAC21、pAC25和pAC31等降解性质粒的一些假单胞菌混合培养，试验初期，向培养基中加入低浓度的2,4,5-T和较高浓度的甲基苯甲酸盐、水杨酸盐、氯代苯甲酸盐，连续培养一段时间后，逐渐增加2,4,5-T的浓度，降低其他物质的浓度，经过近10个月的培养，从中分离获得了一株以2,4,5-T为唯一碳源的细菌，经鉴定为洋葱假单胞菌，命名为AC 1100。 AC 1100具有的降解2,4,5-T的功能是由质粒控制的。 单独以2,4,5-T为唯一碳源进行长期驯化，未能获得以2,4,5-T为唯一碳源的降解菌。 质粒在基因工程中常被用作基因转移的运载工具—载体，同时，质粒中编码降解特殊有毒物质酶系的基因片段可作为外源DNA片段应用于基因工程中。 质粒育种应用的难度 质粒具有不相容性，两种不同的质粒不能稳定地共存于同一宿主内。只有在一定条件下，属于不同的不相容群的质粒才能稳定地共存于同一宿主中； 细菌质粒本身容易丢失或转移，多质粒菌株所携带的质粒比单个的质粒更容易自然消失，重组质粒也面临此问题； 在自然条件下，多质粒超级细菌与土著菌株相比，其竞争力较弱，因而很难成为优势菌株。 第二节 基因工程技术与环境保护 基因工程是在实验室条件下，人为提取供体生物的DNA，用限制性内切酶将DNA片段酶切成不同大小的片段，获得带目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶将其和质粒(载体)的DNA分子重组成新的DNA分子（重组体），然后将重组体导入受体细胞，重组体经过克隆子筛选、鉴定和对外源基因表达产物分离提纯及功能验证，最终获得新的菌株。 基因工程是一种崭新的分子育种新技术，既可实现近缘杂交，又能实现远缘杂交。 一、基因工程操作步骤 目的基因的获取 外源DNA与克隆载体连接 载体转入受体细胞 克隆子的筛选与繁殖 二、基因工程菌的新效能 构建新的微生物 将多种功能基因克隆至同一个受体菌，该菌株成为具有降解多种污染物的新的超级菌株。 形成新的分解代谢途径 将供体生物的特殊功能基因片段转入受体菌后，受体菌具有了新的底物范