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第二章 基因克隆的酶学基础 概述 第一节 限制性核酸内切酶 第二节 DNA连接酶与体外连接 第三节 DNA聚合酶 第四节 DNA及RNA的修饰酶 第五节 其他工具酶 几种酶的定义 工具酶：在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核苷酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。 核酸酶按其水解断裂核酸分子的不同方式，可分为两种类型：核酸外切酶和核酸内切酶 核酸外切酶：从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链。 核酸内切酶：从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片断。 常用的工具酶 工 具 酶 名 称 主 要 功 能 限制性内切核酸酶 在DNA分子内部的特异性的 碱基序列内部进行切割； restriction endonucleases DNA连接酶 将两条以上的线性DNA分子或片段 催化形成磷酸二 DNA ligase 酯键连接成一个整体 ； DNA聚合酶I 通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链 DNA polymerase I 裂口，5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活； 反转录酶 以RNA或DNA链为模板合成互补的cDNA链； reverse transcriptase DNA末端转移酶 将同聚物尾巴加到了线性双链 或单链DNA分子的3’－OH 末端或DNA的3’－末端标dNTP 常用的工具酶 工 具 酶 名 称 主 要 功 能 碱性磷酸酶 去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团； BAP or CIP 核酸外切酶III 降解DNA3’－OH末端的核苷酸残基； exonuclease III 降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或 nuclease S1 寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子； Taq DNA 聚合酶 能在高温（72℃）下的单链DNA为模板， Taq DNA polymerase 从5’→3’ 方向合成新生的互补链 核糖核酸酶 专一性降解RNA； RNase 脱氧核糖核酸酶 内切核酸酶，水解单链或双链DNA； DNase 第一节 限制性核酸内切酶 一、限制性核酸内切酶的分类及命名方法 二、限制性核酸内切酶的基本特征 三、影响限制性内切酶的活性因素 限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 主要从原核生物中分离纯化出来。 （一） 限制性核酸内切酶的分类 分为三种类型: I型酶 ：多亚基的蛋白复合物。有识别位点，在距寄主特异性位点至少1000bp处随机切割，切割长短不一而无特异性。 II型酶 ：通常由一种多肽以同源二聚体形式存在。识别位点为旋转对称结构，切割后形成粘性或平末端。 III型酶 ：两个亚基的蛋白复合物，从距识别位点一侧约25bp处切割DNA分子。 限制性内切酶的命名原则 由分离出酶的微生物的属名第一个字母和种名的前两个字母组成，如Eco(从Esherichia coli大肠杆中分离出的酶）； 微生物的菌株或型写在其后右下角BamH； 若寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则表示为HindI、II、III； 所有限制性内切酶均用一个总名称 endonuclese R,其后再加上述已说明的名称； 如:endonuclese R.HindIII。 ?代表株系和型的字母写在下方不便于打字而在同一水平上书写，如EcoRI. ?命名酶名称不再特别注出限制酶和修饰酶，即略去R与M字母 （二）限制性内切核酸酶的基本特征 1、由宿主控制的限制与修饰