第二讲 HPLC分析技术.pptVIP

第二讲 高效液相色谱分析技术 §2-1 高效液相色谱法概述 高效液相色谱法： (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。 特点： 高压：150~350×105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高速：许多分析都可以在 30min 或更短的时间内完成。 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测） 一、色谱起源 Waters LC-515 1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较 低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测。 占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括 有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测 。 用途广泛，占有机物的80% 2．流动相差别的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 四、HPLC的特点和实际应用 高效液相色谱流程图 §2-2-1 储液瓶 通常采用 0.5~1.0L 的玻璃瓶作储液瓶，在连接到泵入口处的管路上加有过滤 器， 以防止溶剂中的固体颗粒进入泵内， 溶剂过滤器一般采用耐腐蚀的镍合金制成，孔隙大小一般为 2μm. 流动相选择注意事项 纯度高：采用“ HPLC ”级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂黏度要小 溶剂沸点要高于 55 ℃ 溶剂与检测器相匹配 化学稳定性好 溶剂要能完全浸润固定相 流动相配制时的顺序 流动相前处理 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱和高效液相色谱仪输液泵的运动部件 ( 如单向阀和活塞 ) ，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 过滤膜种类： 水系过滤膜 有机系过滤膜 流动相前处理 脱气 目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 。 常用的脱气方法有 : 超声波脱气法、真空脱气法、通氦脱气法和在线脱气机脱气法。目前的仪器生产厂家大多都配有在线真空脱气或氦脱气装置。 气泡对测定的影响： 1）柱压波动，流量偏小 2）基线波动 §2-2-2 输液泵 高效液相色谱仪的输液泵又称高压泵，用于输送恒定流量的流动相。 输液泵基本要求 : 1、泵的结构材料抗化学腐蚀; 2、输出压力达 40~50MPa; 3、无脉冲或安装有脉冲抑制器; 4、泵流量设定值误差 Ss 小于 ±(2%~5%)，流量稳定性误差 SR 小于 ± (2%~3%); 5、梯度准确度误差 Tci 小于 3%，精度优于 1%; 6、泵腔体积小; 7、密封性能好。 §2-2-2-1 输液泵的种类 按动力源的差异，可分为机械泵和气动泵 。 按输液特性，可分为恒流泵和恒压泵。 恒流泵的主要优点是始终输送恒定流量的液体， 与柱压力的大小和变化无关，是定量分析采用的主要方式。 恒流泵按结构的不同，分为螺旋泵(注射泵) 和往复泵。往复泵又分为往复柱塞泵和往复隔膜泵，其中往复柱塞泵是 HPLC 最常用的一种泵，其最大的优点是输液连续，流速与色谱系统的压力无关，泵腔的体积很小(几微升到几十微升)，特别适合梯度洗脱和再循环洗脱，清洗方便，更换溶剂容易。缺点是需要更换柱塞杆密封圈。 恒压泵流量受色谱柱阻力影响，流量不恒定，螺旋泵(注射泵)的缸体太大，这两种泵已经淘汰。 §2-2-2-3