第七章克隆基因的表达----真核.pptVIP

5. 杆状病毒载体系统的优势 5-4、 具有良好的修饰作用，可使表达产物进行磷酸化、糖基化、切除信号肽等。 5-5、 安全 杆状病毒只感染昆虫细胞，对人畜无害，具有可靠的安全性。 6. 杆状病毒大规模表达存在的问题 杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。 22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。 （1）寿命短 感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。 （2）共同转染率低 重组率更低。0.1%-1%。 7. 构建可持续表达的载体 利用AcMNPV的一个早期基因IE1的启动子。 IE1基因的转录不依赖与病毒的其他基因产物，而且在昆虫细胞中表达正常。 把外源基因插入到IE1启动子和IE1终止子之间。构成整合型载体。 载体转染宿主细胞后随即整合到宿主染色体上，实现外源蛋白的持续表达。 载体 IE1启动子 外源基因 IE1终止子 载体 在酵母中表达 昆虫培养细胞表达系统－－杆状病毒 外源基因在植物中表达－－Ti质粒 在哺乳动物细胞中表达－－ SV40病毒 三、外源基因在植物中表达 根瘤 存在于能引起植物形成冠瘿瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。 1. Ti质粒: Ti plasmid 环状双链DNA，1.5×105-2.0×105bp（185kb） (相当于细菌染色体的3%-5%）。 （1）Ti质粒的结构 转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。 左边界 右边界 生长素 基因 细胞分裂 素基因 冠瘿碱 合成 ①T-DNA（transfer-DNA） 生长素基因: iaaM（tms1）和iaaH（tms2）编码合成吲哚乙酸（植物生长激素）的酶 iaaM: 色氨酸-2-单加氧酶 色氨酸-2-单加氧酶 色氨酸 吲哚-3-乙酰胺 iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶 吲哚-3-乙酰胺水解酶 吲哚-3-乙酰胺 吲哚乙酸 细胞分裂素基因 tmr（ipt）：异戊烯转移酶, 催化： 二磷酸异戊烯（IPP） 异戊烯酰嘌呤单磷酸（IPA） 5’-AMP 章鱼碱（octopine) 胭脂碱（nopaline） NH-(CH2)3-CH-COOH NH CH3-CH-COOH HN=C NH2 NH-(CH2)3-CH-COOH NH HOOC-(CH2)2-CH-COOH HN=C NH2 Arg与丙酮酸缩合成 Arg与?酮戊二醛缩合成 冠瘿碱（opine）的类型和化学结构 农杆碱（agropine） 冠瘿碱（opine）的作用 冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。 Glu的二环糖衍生物。 ②毒性基因（vir） 决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移， 进入和整合。 vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIR D2蛋白结合，并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助下穿过浓杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上。 单链的5’端是右边界区域，含有25bp重复序列，参与整合。 章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因： ④不相容性基因 控制Ti质粒的不相容性。 ③冠瘿碱代谢基因 分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶。维持农杆菌生长。 （1）第一步:植物受伤 植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、?羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。 2. 农杆菌的感染和生存 （2）第二步 感染植物 （3）第三步 毒性基因（vir）表达 T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。 脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。 virA、virG、virD、virB （4）第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。 （5）第五步 诱导冠瘿瘤 （6）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。 3. Ti质粒的种类 根据所编码的冠瘿碱（opine），分为 （1）章鱼碱（octopine)型质粒 （3）农杆碱（agropine）型质粒 （2）胭脂碱（nopaline）型质粒 裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米）。 （1）能够自发地整合到植物的染色体上。 （2）能转化多种植物。 （3）强启动子 4. Ti质粒转化的对象 5. Ti质粒作为载体的可能性 T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。 25 （1）分子量太大（200kb）！ （2）限制性酶切位点太多。 （3）被