第四章 液相色谱流动相和固定相.pptVIP

第四章 液相色谱流动相和固定相 4.1液相色谱流动相 4.2高效液相色谱常用固定相 4.3其它基质材料的液相色谱固定相 4.4生物大分子分离分析固定相 流动相 (Mobile phase) 液相色谱流动相溶剂的选择步骤： ● 选择具有合适物理性质的溶剂，如沸点、粘度、紫外截止波长等 ● 选择合适洗脱强度的溶剂：简单样品，2 ≤ k’≤ 5；复杂样品，0.5 ≤ k’≤ 20 ● 改变溶剂的选择性，使被分离组分具有较高的α值 流动相溶剂的选择 液相色谱中的溶剂强度 洗脱强度与溶剂极性 溶剂强度图 混合溶剂的极性 溶剂选择性分类 溶剂的选择性 流动相的优化 梯度洗脱技术 1．梯度洗脱的特点 4.1 液相色谱流动相 4.1 液相色谱流动相 4.1.1 Snyder溶剂理论 1.溶剂的强度和极性 溶剂的极性参数P：表示溶剂与三种极性物质乙醇（质子给予体）、二氧六环（质子受体P）和硝基甲烷（强偶极体）相互作用的强度。 二元混合溶剂有 ： 2.溶剂的选择性 xe、 xn 、 xd分别反映了溶质接受质子、给予质子和偶极作用的能力。 I组溶剂的xe值都比较大，质子接受体溶剂； V组溶剂的xd值较大，属偶极作用力溶剂；VIII组溶剂的xn值较大，属质子给予体溶剂。 同组溶剂有相似的选择性，不同组溶剂分离选择性差别较大。 2.溶剂的选择性 冲洗强度相同，但选择性不同的冲洗剂有时被称为等冲洗强度冲洗剂。 对于某些种类化合物的分离，流动相中必须加入一些添加剂，如缓冲试剂、离子对试剂或其它的修饰剂(如三乙胺)，以改善色谱峰的重复性、分离选择性和色谱峰形。 4.1.2正相色谱常用流动相 正相色谱是指固定相的极性大于流动相的极性，包括硅胶吸附色谱和正相键合色谱。流动相与固定相间的相互作用越强，溶质吸附就越弱，溶质的保留值就越小 。 对于正相色谱中常用的冲洗剂可按其吸附强度进行分类。这种分类称为洗脱能力序列，通常以ε0值作为溶剂强度参数，它与溶剂强度成正比。 1.等度冲洗 1.等度冲洗 4.1.2正相色谱常用流动相 2、梯度冲洗 在正相色谱中，经常遇到的是多种组分的复杂样品中同时有极性差别很大的物质，采用等度冲洗很难找到一个合适的溶剂强度。梯度冲洗是随着时间的改变冲洗剂强度也发生变化的冲洗方法，它可使极性相差大的组分在合理的时间内全部流出色谱柱，同时具有良好的分离度，适用于容量因子大于20的体系。 在正相色谱中，溶质和溶剂与固定相的作用对保留值和选择性均起重要作用。正己烷常用作冲洗剂的弱组分，因而冲洗剂的强组分不仅用于调节溶质的保留值使之在适当范围内，并且使分离选择性也发生了变化。 4.1.3反相色谱常用流动相 4.1.3反相色谱常用流动相 反相色谱中常用有机溶剂的结构参数，其中Vw是溶剂的范德华体积，它与分子的极化率或疏水作用力的强弱成比例，π*是偶极作用参数，βm和αm分别表示溶剂分子接受质子和给予质子的能力。 反相色谱中最常用的冲洗剂强组分，其范德华体积的大小顺序为： 四氢呋喃＞二氧六环＞乙腈＞甲醇 4.1.3反相色谱常用流动相 四氢呋喃的分子体积最大，亦即其色散作用力最强，疏水作用也最强，对样品的冲洗强度最大。 比较溶剂π*值可得其极性顺序为： 甲醇＞四氢呋喃＞二氧六环 比较βm和αm值可知，甲醇给予质子和接受质子的能力最强，亦即氢键作用力最大。 4.1.3反相色谱常用流动相 100%甲醇的洗脱强度相当与89%乙腈/水的洗脱强度，也相当与66%的四氢呋喃/水的洗脱强度 选择不同的有机溶剂作冲洗剂强组分，不仅对分离物质的保留值有影响，而且对溶质的选择性也会有影响。 4.1.3反相色谱常用流动相 反相色谱中酸度的影响 反相色谱所使用的流动相是以水为基本溶剂的，对于可以离解的组分可以通过调节流动相的pH值改变组分的选择性。 通过改变pH值使组分由分子离解为离子，优先进入流动相而使其保留值减小，或者抑制组分的离解，减小色谱峰的拖尾现象。 对于中性化合物而言，改变流动相的pH值对其保留值影响很小。在反相色谱中，通过在流动相中加入缓冲溶液来控制流动相的pH值。 4.1.4反相离子对色谱流动相 对强酸/强碱及其它离子型化合物，为使其在C18或C8柱上有适当的保留,则需在冲洗剂中加入相应的反离子,即离子对试剂。这种在反相色谱体系中加入离子对试剂的方法通常称为反相离子对色谱法。 1.离子对试剂的选择 所选用的离子对试剂的电荷应与被分离样品的电荷相反。如对酸性或带负电荷的溶质，多用带有正电荷的季铵盐作为离