PCR的原理操作步骤.pptVIP

PCR的基本原理、操作步骤、注意事项及临床应用 济宁医学院附属医院检验科 贾印峰 聚合酶链反应 聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR），是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。通过体外扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍地放大，从而极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞甚至一个分子水平。 一、PCR的基本原理 　PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 1. PCR反应体系: DNA 聚合酶 　　　　　　　　 DNA 靶序列 　　　　　　　　 两端引物 　　　　　　　　 脱氧核苷酸 dNTPs 　　　　　　　　 缓冲液 2. DNA的合成方向 5’ 3’ 3. Taq DNA聚合酶的作用 4. PCR循环： 变性 　　　　　　　 退火 　　　　　　　 延伸 PCR 循环 第一步 － 变性（９３～９８℃） ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； PCR循环 第二步 － 退火 （３７～６５℃） ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； PCR循环 第三步 － 延伸 （７０～７５℃） ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 第一个 PCR 循环 － 靶序列完成复制 实时荧光定量PCR原理 ?实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 荧光定量PCR原理 一个重要概念 ???? Ct 值的定义 ????在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的最小循环数（如下图所示）。 Ct值的意义 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系  我科开展的PCR检验项目 乙 肝 病 毒（HBV－DNA） 丙 肝 病 毒（HCV－RNA） 结 核 杆 菌（TB－DNA） 肺 炎 支 原 体（MP-DNA） 淋 球 菌（NG－DNA） 沙 眼 衣 原 体（CT－DNA） 解 脲 支 原 体（UU-DNA） 单纯疱疹病毒Ⅱ型 （HSV Ⅱ －DNA） 乳头瘤病毒6,11型 (HPV6,11－DNA) EB 病 毒（EB－DNA） 巨细胞病毒（CMV－DNA） 标本的采集、验收和保存 1 标本的采集 a）血液标本：用真空采集管采集血液标本，血标本采集后在2小时内（检验单与标本一道）送达实验室（HCV采用EDTA抗凝的血浆）。离心后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经高压灭菌的1.5ml的离心管中，输入病人基本信息，编号。 b）痰标本：用带盖的无菌一次性塑料瓶收集清晨肺深部痰标本送检。（对于无痰或少痰的患者，可用45℃加温的100g/L NaCl水溶液雾化吸入或改变体位以使痰液易于咳出；对于小儿可以轻压胸骨柄上方以诱导咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集标本。）标本在室温下保存不能超过24小时。 c）生殖道拭子：尿道或阴道分泌物由医生用专用取样拭子（灭菌，一次性）采集样本，及时送检。采集生殖道拭子标本，要求病人在采样前2小时内不能排尿，采样时，将棉拭子伸入男性尿道及女性宫颈口2～3cm，转动