细胞原代培养--吉珠.pptVIP

原代细胞培养实验 李 晶 莹 实验目的和要求： 掌握无菌操作技术。 了解小鼠解剖操作技术。 了解原代细胞培养的一般方法与步骤。 了解培养细胞的消化分散。 了解细胞计数方法。 了解倒置显微镜的使用。 实验原理 细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。还可以利用培养细胞制备染色体，分析外界因素（如理化因素）对细胞的影响，研究细胞癌变等等。在细胞培养的基础上发展了细胞融合、细胞杂交等细胞工程技术及单克隆抗体技术。（分为植物细胞培养及动物细胞培养） 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 直接从有机体获取的细胞进行的培养是原代培养。 将培养细胞洗脱后转移到另外的容器中进行在培养叫做传代培养。 实验内容： 1.工作环境及表面的处理（超净台的使用） 超净台表面的处理。 a. 应做到每日清洁，以使操作中溅出的培养液或其它液体及时被清除而不蓄积，达到杜绝细菌和真菌繁殖的目的。 b. 工作台中只限放置每日工作所必需的物品，其他非必须物应当除去。 c. 日常的清洁工作包括：用70%的酒精或10%的新洁而灭擦洗工作台。用固定的容器装废弃液。 d.每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。操作间隔应让无菌操作台运转10 min以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2.细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 用于细胞培养的器材包括：细胞培养瓶，细胞培养板，吸管，各种瓶子等。 目前，上述器材均可以从商家买到无菌一次性的用品。但是，成本太高。 玻璃器材，经过湿热或者干热灭菌后可以反复使用。 不宜进行高温高压灭菌的器材，可以浸泡在70%乙醇中进行消毒，并在超净台上吹干。 3.实验者的操作技术 无菌操作的原则：保证细胞培养板，细胞培养皿，细胞培养瓶内部以及吸管包裹层等内部的无菌状态。 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 %酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装置的工作间里进行。 培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开 。 装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外打开。  细胞培养中液体的吸取，均需机械移液装置移取。切勿采用口吸的方法。口吸是最大的微生物污染源，更重要的是细胞培养液及成分通过食入或吸入的方式及入人体，可能对研究人员造成伤害。 细胞培养瓶在超净台中打开后，瓶盖应盖顶超下放置与工作台中。 如果培养的细胞已经被污染，切勿直接倒掉，应高压灭菌后倒掉处理。 湿润的培养箱是常见的污染源。通常由充满液体的托盘提供培养箱合适的湿度，然而托盘本身及可导致各种细菌和真菌的污染，这种污染还可能存在与培养箱壁上和提供气体的管道上。应该定期对培养箱进行加热处理。也可以采用70%乙醇擦洗表面，并定期更换输送CO2管道，并将该管子浸泡与20%的含氯漂白剂中消毒。 不应用的细胞应及时丢弃处理，不应继续放置于培养箱中不予理睬。 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。  定期检测下列项目： 1. CO2 钢瓶之CO2 压力 2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。  水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 4. 维持细胞生长所需培养液的无菌处理 基本培养液由必须氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和作为生长因子、激素和贴壁因子来源的血清组成。一般用碳酸氢钠（NaHCO3)体系进行缓冲。 细胞的生长不仅产生CO2，也需要CO2才能生存。所以，细胞的培养需要在CO2培养箱中进行。 CO2培养箱中CO2的浓度应与培养液中碳酸氢钠平衡。如果CO2的浓度为5%，则配培养液中应加入1.97g/L的碳酸氢钠。 培养瓶盖应轻轻的拧上，不要完全拧死，以保证气体的交换。 培