第九章 分子克隆技术(1).pptVIP

克隆载体必备条件 表达载体的必备条件 (1)能自主复制 (2)具有方便、灵活的克隆位点和筛选标记 (3)具有能为 RNA聚合酶识别的强大启动子 (4)启动子应可受诱导调控 (5)具有强终止子 (6)具有翻译起始信号 质粒的命名： 用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。 如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。 2 噬菌体载体 2.1 噬菌体的结构及其核酸类型 2.2 噬菌体的生命周期 t=0 噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入； t=1 寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭； t=2 第一个噬菌体mRNA开始合成； t=3 细菌DNA开始降解； t=5 噬菌体DNA合成开始启动； t=9 “晚期”噬菌体mRNA开始合成； t=12 出现完整的头部和尾部结构； t=15 出现头一个完整的噬菌体颗粒； t=22 细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体颗粒 2.3 λ噬菌体载体 2.3.1 λ噬菌体的分子生物学概述 2.3.2 λ噬菌体载体 2.3.2 λ噬菌体载体 λ噬菌体载体可分为： 插入型载体：具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入 替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代,可承受较大分子量的外源DNA片段的插入 （i）插入型载体 外源的DNA克隆到插入型的λ载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。插入型的λ载体又可以分为免疫功能失活的和大肠杆菌β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。 ①免疫功能失活的插入型载体： 在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插入的λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。 （i）插入型载体 ②β-半乳糖苷酶失活的插入型载体： 这种载体的基因组中含有一个编码大肠杆菌β半乳糖着酶基因lacZ的区段。由这种载体感染的大肠杆菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了β-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成β-半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。 蓝白斑筛选 （ii）替换型载体 替换型载体又叫做取代型载体（substitutionvector），是一类在λ噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。 λNM781便是其中的一个代表。在这个替换型载体中，可取代的EcoRI片段，编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基因）,由于这种λNM781噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变更被抑制了，能在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。 用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：第一，应用适当的核酸内切限制酶消化λ载体，除去基因组中可取代的DNA区段。第二，将上述所得的人DNA臂同外源DNA片段连接。第三，对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体。 2.4 M13噬菌体载体 6.4 kb单链环状正链DNA基因组。 M13噬菌体作载体的优点： (1) 单链DNA,是以双链环形DNA为中间媒介, 这种复制形式的DNA,可以同质粒DNA一样,在体外进行纯化和操作； (2) RF DNA (复制形式) 和SS DNA（单链）都可感染E.coli，产生噬菌斑；可用蓝白斑进行筛选； (3) 无包装限制问题（可6倍于M13基因组）； (4）可产生能直接测序的单链DNA分子。 2.5 cosmid（柯斯质粒）克隆载体 cosmid（cos site-carring plasmid） 人