色谱条件的开发.pptVIP

液相色谱条件的分析和建立主讲人 :李效宽日期 :  目标 合适的分离度 合适的分离时间 容易获得的流动相 合适的柱压降 可以重复的色谱图 色谱柱的选择 根据分离方式分类 (1)正相：SiO2； CN；NH2；苯基 (2)反相：C18；C2；C4；C8；CN；NH2 ；苯基 (3)离子交换：弱碱阴离子交换；弱酸阳离子交换 强碱阴离子交换；强酸阳离子交换 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等 (4)凝胶过滤：水溶性凝胶过滤；油溶性凝胶过滤 (5)其它类型：手性柱等 不同类型样品的方法选择 色谱柱填料选择 粒度均匀（3，3.5, 5 um), 粒径小，柱压高，理论塔板数高，容易堵柱。 低酸度表面(硅醇基团被屏蔽），可以减少拖尾 宽的pH 范围，可以有较大的调节自由度 色谱柱选择 长度：75mm,150mm,250mm,压力和理论塔板正比与柱长 直径：2mm,4.6mm,10mm 粒径：3um, 3.5um, 5um 孔径：100A,300A 流动相选择 低黏度，低紫外吸收，化学稳定，容易获得 甲醇：极限波长210nm, 有毒，挥发，低黏度 乙腈：极限波长210nm, 有毒，黏度低于甲醇 THF: 极限波长240nm, 有毒，平衡时间长，不稳定，气味难闻 水：极限波长210nm, 无毒，黏度高，长霉菌 总结 Just how good is good enough? Just how good is good enough? 可以接受的分离应该是1k20,or 2k10 better。 K=(tr-t0)/t0 T0指 死时间，一般相当于溶剂峰出峰时间 K 与流速变化关系不大，K小受干扰大，k大则分析时间太长。 峰的形状（peak shape) 理论塔板数 理论塔板数 N=3000*L(cm)/dp(um) 对于一根150mm,5um的色谱柱其塔板数约为3000*15/5=9000,如果低于此值应该考虑退货或者更换此柱。 分离度 w1 ,w2是峰1峰2的基线宽度 W0.5,1,w0.5,2是峰1和峰2 的半高峰宽 分离度 1 代表柱效，与N的平方根相关 2 选择性α=k2/k1 K=(k1+k2)/2,当k值较大时对Rs影响不大 分离度与k（容量因子）的关系 所以分离的第一步就是控制1k20,或者最好是2k10 方法：有机相100%,90%,80%,70…… 每减少10%,k值变化为2.5~3倍 分离度80%-70%-60% 分离度（48%-47%-46%) 更换有机相 a :甲醇-水 b:THF-水 c:甲醇：THF:水 总结 1调节有机溶剂比例(10%)使k值可以接受 2 微调有机溶剂比例(1%)，使分离完全 3 更换有机溶剂MeOH,THF,CAN 4 混合使用有机溶剂 记录每一次条件变化对谱峰的影响 其他控制选择性的因素 流动相pH值 柱温 不同品牌色谱柱 离子对试剂 流动相pH值 1,2 酸性化合物 4,5碱性化合物 3中性化合物 图中曲线的拐点为该化合物的pKa pH5~7之间会有较好的分离，5附近比较稳定 流动相pH值 流动相pH值 pH值的影响 一组苯甲酸同系物的分离情况 A: pH 2.5 B: pH 3.0 C: pH 3.5 D: pH 4.0 pH值的影响 pH值必须在该缓冲盐的pKa±1以内才有较好作用，超过此范围，会使得色谱条件不稳定，重复性较差 由此得出磷酸盐缓冲液可用于pH 2.0-3.1,6.2.-8.2 醋酸盐缓冲液可用于pH 3.8-5.8 不同流动相柱效不同 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18 4.6×250mm 5um，柱温 ：室温，波长 ： 203nm 流速 ： 1.0ml/min 2.梯度：乙腈：水为流动相 1.流动相：乙腈：水（22：78）为流动相 0min 20 : 80 柱效:11500 20min 40 : 60 人参皂苷Rg1 (样品) 柱效:60000 柱温的影响 温度变化1度，Rt变化1~3% A: 30℃ B: 35℃ C: 40℃ D: 45℃ 温度控制对定量分析很重要 更换色谱柱的影响 A C8柱 B 苯基柱 C 氰基柱 更换色谱柱的影响 A C8柱 B 苯基柱