第13章 分子生物学方法2.pptVIP

第13章 分子生物学方法 教学内容 掌握基因克隆的原理 掌握PCR的原理 了解核酸的体外标记 了解分子杂交技术 了解DNA芯片技术 了解原核基因表达系统 了解真核基因表达系统 核酸的体外标记 分子生物学试验中需要检测的核酸通常都是极微量的，常在纳克至微克水平，甚至在皮克水平，难以通过紫外光吸收或直接的显色反应来定量定性。 核酸的体外标记和分子杂交技术可以检测出样品中少于1000个分子的核酸，因而是分子生物学各领域中不可缺少的检测手段之一。 核酸杂交的原理 ：就是将具有一定长度互补序列的两条核酸单链在适当条件下退火，按碱基互补配对的原则形成杂合双链分子，如杂合的DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/RNA，杂合分子中两条单链之一为靶分子（或待测核酸），另一条为探针（通常序列已知）链。探针链上带有放射性或非放射性的标记，放射性标记可以通过放射自显影等方法检测，而非放射性的标记一般通过酶催化底物进行显色反应将信号放大。这样可以大大提高检测核酸的敏感性，仅皮克极核酸就可以检测出来。 核酸探针的种类 放射性标记的核酸探针 32 35 常用的放射性同位素是 P和 S 32 35 P的半寿期为14.3天，S的半寿期为87.4天 优点：灵敏 缺点：对人体健康有危害，要求有防护条件，废物处理麻烦，使用时间受半寿期限制。 非放射性标记的核酸探针 半抗原类的生物素、地高辛等 优点：灵敏，安全可靠，探针可以反复利用 缺点：检测过程繁琐 非放射性标记的核酸探针 原理：将生物素标记到探针上，通过抗原抗体反应，利用偶联的碱性磷酸酶催化不同的底物进行显色反应或产生可发出荧光的物质。 探针标记的方法 切口平移法 DNA酶Ⅰ和DNA polⅠ共同作用导致切口平移，合成的新链有放射性同位素掺入 随机寡核苷酸引物标记 用随机合成的六聚寡核苷酸作为引物，与变性的单链DNA退火， 酶催化引物起始合成和延伸DNA,掺入同位素 末端标记 末端转移酶将32 标记到 DNA的5’端或3’端 P 分子杂交技术 Southern印迹杂交 DNA与DNA杂交，检测的是DNA Northern印迹杂交 DNA与RNA杂交，检测的是RNA 荧光原位杂交 使用荧光底物标记的探针，将组织切片或细胞固定在载玻片上，DNA的变性、杂交、检测都在载玻片上进行。通过荧光显微镜直接观察结果。 Southern印迹杂交 将基因组DNA 或其他DNA片段先用限制性内切酶彻底酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳分离DNA 片段。 电泳结束后，琼脂糖凝胶经碱性溶液处理，使DNA 样品变性。 DNA 转移印迹到硝酸纤维素膜或尼龙膜等固相介质上。 用标记的核酸探针杂交。 检测印迹到膜上的特异性的DNA 的位置。 这种方法主要用于检测基因组或大片段DNA 某一区域中特异性片段的插入或缺失，以及基因片段的定位。 检测蛋白质与DNA结合的常用方法 凝胶阻滞 凝胶阻滞可以检测某种DNA 是否与蛋白质结合。原理：DNA与蛋白质结合后，DNA-蛋白质复合物的分子量会比原来的DNA片段增加，在凝胶种的迁移速度会降低。利用这个简单的原理，将目的DNA片段用同位素标记后与蛋白质样品混合，再经凝胶电泳分离，可以通过放射自显影判断DNA是否与蛋白质结合。 足印法 足印法可以检测蛋白质在DNA上的结合位点。 足印法 足印法可以检测蛋白质在DNA上的结合位点。 原理：蛋白质与DNA结合后，结合位点及其附近的DNA序列会由于蛋白质的保护作用而免受核酸酶或化学试剂的攻击，因此在用核酸酶或化学试剂处理DNA时，这些位点的DNA链不会断裂。 试验操作：将DNA片段种的一条链的末端用同位素标记后，与蛋白质混合，然后用适当浓度的DNA酶Ⅰ处理DNA-蛋白质复合体， 使DNA链断裂。然后将蛋白质与DNA彻底解离，将与蛋白质解离后的DNA变性，进行凝胶电泳分离，最后进行放射自显影。 DNA 芯片 DNA 芯片是将许多特定的DNA寡聚核苷酸片段或cDNA片段固定在载体上的若干个预先设定的区域内，根据碱基互补配对原理，将待测样品用荧光标记后同芯片进行杂交，然后检测杂交信号强度并进行计算机分析。 DNA芯片的基本原理就是核酸分子杂交 优势：能同时定量或定性地检测大量的基因信息，点样、杂交、图像处理和数据处理都可以利用计算机自动或半自动完成。 主要应用于功能基因组学、疾病的临床诊断和检测等。 基因芯片的制作方法主要有两种： 一种是直接在芯片载体上合成寡聚核苷酸的原位合成法；