1-亲和分离纯化胰酶课件.pptVIP

亲和层析 分离纯化胰蛋白酶 一 实验原理 我们都知道酶和它的底物或竞争性抑制剂，特异性抗原和抗体，激素及其受体等具有专一性很强的亲和能力。亲和层析是利用生物分子间所特有的专一亲和力而设计的一种层析技术。 亲和层析就是在一种载体上，用化学偶联的方法，接上特定的配基作为固相支持物，然后装柱，并在适当的条件下当样品通过柱子时，其中与配基具有特异性亲和力的组分被吸附在柱上，然后通过改变洗脱条件，使得该组分被洗脱分离开来。 亲和层析是具有快速、高效等特点，对于那些分离流程长、难度大、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说，亲和层析显示出其独特的优越性。 通过亲和层析，被分离物质的纯度有时一次即可高达数百倍，活性回收率纯度也非常之高。亲和层析先决条件是，不同的分离对象需要选择接有专一性配基的固相化亲和载体，有关载体的活化、接臂、偶联，详见相关一书。 二 实验目的与要求 本实验通过制备接有鸡卵类粘蛋白的Sepharose 4B，采用亲和 层析分离纯化胰蛋白酶。 通过该实验要求了解和熟悉制备亲和载体中有关活化和偶联的方 法，并掌握亲和层析纯化胰蛋白酶及酶活性测定的技术。 三 实验主要器材 3-1、实验设备 （1）、 紫外-可见分光光度计 （2）、 多用途恒温振荡器 （3）、 自动部分收集器 （4）、 色谱工作站装置 （5）、 微型旋蜗混合器 （6）、 电动磁力搅拌器 （7）、 笔记本电脑 （8）、 紫外检测仪 （9）、 恒流泵 3-2、实验器皿 （1）、层析柱 （2）、砂芯漏斗 （3）、抽滤瓶 （4）、可调取液器 （5）、量 筒 （6）、试 管 （7）、烧 杯 （8）、滴 管 （9）、玻 棒 图1亲和层析实验装置 四 试剂与配制 4-1、实验试剂 （1）、 三羟甲基氨基甲烷 （2）、 1，4-二氧六环 （3）、 鸡卵类粘蛋白 （4）、 Sepharose 4B （5）、 环氧氯丙烷 （6）、 胰蛋白酶 （7）、 碳酸氢钠 （8）、 氢氧化钠 （9）、 碳酸钠 （10）、氯化钾 （11）、氯化钙 （12）、氯化钠 （13）、盐 酸 （14）、甲 酸 4-2、试剂配制 （1）、0.5 mol/L NaCL 溶液： （2）、56% 的1、4-二氧六环溶液： （3）、 2.0 mol/L NaOH溶液： （4）、碳酸钠—碳酸氢钠缓冲液[0.2 mol/L pH9.5] ： （5）、胰蛋白酶样品溶液[16mg/ml] ： （6）、鸡卵类粘蛋白溶液[15mg/ml] ： （7）、亲和柱平衡液 [ 0.1 mol/L pH7.8 Tris-HCL含0.5mol/L KCL和0.05mol/L,CaCL2] ： （8）、亲和柱洗脱液[0.1 mol/L pH 2.5甲酸溶液含0.5 mol/L KCL]： 五 实验操作步骤 (一)、亲和层析吸附材料的制备