分子生物学实验1-核酸分子杂交.pptVIP

实验目的 掌握植物总RNA的提取及凝胶电泳检测的原理及方法并能熟练操作 对于不同的植物组织，选取不同的提取方法，提取植物的总RNA 重点掌握Northern杂交基本原理、基本实验步骤和检测方法 利用Northern杂交检测目的基因的时空表达情况，如不同生长发育阶段、不同的组织部位、不同生长环境等条件下相关基因的表达情况 分子杂交 核酸分子杂交，其中又包括Southern杂交及Northern杂交。 属于蛋白质分子“杂交”的Western杂交。 核酸分子杂交是指非同一分子来源但具有互补序列(或某一区段互补)的两条多核苷酸链，通过Watson—Crick碱基配对形成稳定的双链分子的过程。 杂交的双方是待测核酸及探针（probe） 待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是基因组DNA或总RNA 被人为标记上，该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓的探针。 分子杂交是进行核酸序列分析，重组子鉴定，及检测外源基因整合及表达的强有力的手段。 要证明外源基因在植物染色体上整合的最可靠的方法是，只有经分子杂交鉴定过的植物才可以称为转基因植物。 同时也可以利用Northern杂交来检测不同生长发育阶段和不同的组织部位相关基因的表达情况。 Northern杂交是以DNA或RNA为探针，检测RNA链，用于外源基因转录产物特异mRNA的检测。 将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，不同的RNA分子将按分子量大小依次排布在凝胶上，将它们原位转移到固相膜上，在适宜的离子强度及温度下，探针与膜上同源序列杂交，形成RNA-DNA杂交双链。 利用探针中的digoxigenin和anti-digoxigenin-Ap抗体结合，再通过碱性磷酸酶AP与CDP-star底物作用，检测CDP-star的化学发光间接进行定量分析。 若经杂交，样品中无杂交带出现，表明虽然外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。 实验原理－RNA提取 细胞破碎，核酸溶出 液氮速冻后，对植物组织进行研磨可以破碎细胞。 细胞提取液可溶出核酸。 核酸的纯化 DNA的去除 酚、氯仿抽提使蛋白质变性、沉淀，可去除蛋白。 多糖、次生代谢物 核酸的保护（内源RNA酶） 低温、苯酚、氯仿、SDS可以部分抑制RNA酶的活性，保护RNA不被酶解。 探针 探针序列需与感兴趣的基因互补 探针需要有荧光或同位素标记以利于检测 长度一般为25-2000bp的DNA或RNA 核酸分子杂交又可分为 核酸在体外与探针杂交（膜上印迹杂交） 在细胞内进行杂交（细胞原位杂交） 分子杂交可以在液相及固相中进行，目前实验室中广泛采用的是在固相膜上进行的固－液杂交。 膜上印迹杂交 将待测的DNA或RNA分子经琼脂糖凝胶电泳分离后原位转移到固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上 杂交液（液相）中的探针与印迹到固相膜上的特异片段发生杂交 分子杂交的实验涉及到的三项技术 核酸凝胶电泳技术 印迹技术 分子杂交技术 分子杂交的实验涉及到的三大内容 制备被检的核酸或蛋白质样品(或标本) 制备杂交探针 印迹及杂交 实验设备 常规设备 移液器，tip头，离心机 RNA电泳 金属浴，水平凝胶电泳仪，微波炉，紫外凝胶成像系统 紫外分光光度计 转膜过程 3M滤纸，普通滤纸，尼龙膜，托盘，玻璃板，封口膜，1000克重物，吸水纸，保鲜膜，手术刀片，刀柄 预杂交、杂交 水浴摇床，杂交袋，封口器 洗膜、信号检测 摇床，杂交袋， X-光片，暗室，暗盒 实验试剂 RNA提取液（TSE） 100 mmol/L Tris-Cl pH8.5 20 mmol/L EDTA pH8.5 200 mmol/L NaCl 1%SDS PVPP 、 β-巯基乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇 琼脂糖、MOPS、EB 20×SSC: 3 mol/L NaCl，1.3 mol/L 柠檬酸钠（PH 7.0） 鲑精DNA 杂交液：7% SDS，50mmol/L Na3PO4（pH 7.0），2% blocking stock solution，5×SSC，50％甲酰胺，0.1%Sodium N-lauroyl Sarcoine Buffer I: 0.1 mol/L maleic acid， 0.15 mol/L NaCl（pH 7.5） Buffer II: 10% blocking stock solution (Anti-dig) Buffer III: 0.1 mol/L Tris，0.1 mol/L NaCl (pH9.5) (CDP-star) Washing 1：2×SSC，0.1% SDS Washing 2：0.1×SSC，0.1% SDS 显影液、定影液 羊草