基因工程技术讲义2007.pptVIP

基因工程下游技术 基因工程属于生物技术范畴，生物技术通常分成发酵工程、细胞工程、酶工程、基因工程和蛋白质工程等。 生物技术以生命科学为基础，以基因工程为核心，将多种基础科学联合并使之产业化。 国内外生物制药行业状况 目前美国和欧洲分别拥有生物技术公司1300家和700家。 在美国，已批准上市的产品有 重组α-1干扰素、重组α-2a干扰素、重组α-2b干扰素、重组β-1a干扰素、重组β-1b干扰素、重组γ-1b干扰素、重组白介素-2、重组白介素-11、重组红细胞生成素、重组人胰岛素、重组人粒细胞集落刺激因子、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组组织型纤溶酶原激活物、重组血小板源性生长因子、重组Ⅶa因子、重组人Ⅷ因子、重组人Ⅸ因子、重组人生长激素、重组链球菌DNA酶α、重组乙型肝炎疫苗、重组乙型肝炎核心抗原、重组抗CD20单抗、重组抗白介素-2α受体抗体、重组抗癌胚抗原抗体、重组β-葡糖脑苷脂酶、重组干细胞因子等等。 700种生物技术药物正在进行临床研究和FDA评估，200种以上产品已到最后批准阶段(Ⅲ期临床与FDA评估)。 我国批准上市的生物工程药物已有17种 1989 ：IFN-α1b 1996： rSK IFN-γ EGF 1997： IFN-α2a IFN-α2b IL-2 G-CSF GM-CSF EPO b-FGF HGH 1998 ：Insulin 2002： ProUK 2003：TNF 2004：rSAK 2005： TPO 还有各类疫苗40 余种 基因工程的主要流程 原始材料? 上游过程?发酵或生物转化?下游过程?转化产品 原始材料包括菌种，载体，工具酶，培养基等。 上游过程是对菌种加以改造，提高生产能力或者导入外源基因等以获得工程菌，即基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序 。 发酵或生物转化：是通过优化发酵条件如温度、营养、供气量等，利用工程菌的生物合成，加工和修饰等以获得目的产物发酵或大规模培养。 下游过程（Downstream）指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。生物技术产品工业化的实践证明，生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。 最后纯化产品经分装冻干，包装后即为成品。 表达系统 大肠杆菌 选择合适的表达载体：有强启动子，如Plac、Ptrp、Ptac、PL/PR启动子等。 选择合适的宿主： Lac 启动子——LacI菌；PL/PR——CI857溶源菌 诱导表达：温度诱导——PL/PR，IPTG的化学诱导——Plac、Ptac 表达类型：融合、非融合、分泌型，提高表达蛋白的稳定性，避免产物降解。 优点：操作简单，产量高，成本低。 缺点：表达产物缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 芽孢杆菌 棒状杆菌 乳酸菌 2 真核细胞表达 酵母 表达载体：诱导型载体如pBM150(GAL1启动子)，pAM82(PHO5启动子)；组成型载体pAAh5(ADH1启动子)。 宿主细胞：营养缺陷型菌株如URA3－，LEU2－，HIS3－，TRP1－等。 动物细胞 表达载体：SV40复制起点，病毒启动子 （CMV，SV40 等） 宿主细胞：人Hela细胞，猴COS细胞，小鼠3T3细胞，CHO细胞等 植物细胞 表达载体：CaMV-35S启动子，Ti质粒左右边界 宿主细胞：烟草TBY2细胞 优点：表达产物经过正确修饰，一般具有天然活性。 缺点：操作比较复杂，表达量较低，成本较高。 工程菌高密度培养与发酵 外源基因的高水平表达,不仅涉及宿主,载体和克隆基因三者之间的相互关系,而且与其所处的环境条件息息相关。利用发酵罐或生物反应器实现细胞的高密度培养可以提高目标产物的浓度,利于提取与纯化。 发酵控制：培养基的配方的优化筛选以提高营养效价，降低消耗定额；发酵条件的优化，包括通气（溶氧）、温度、pH、拌搅参数，培养过程产品生物合成的动力学等。 发酵的培养模式：分批、连续和补料分批 重组蛋白的表达定位 1、细胞质表达 在这种情况下，必须破坏细胞结构才能得到目的蛋白质，同时伴随着大量核酸和其它上千种宿主蛋白质的释放；表达量高时容易在细胞内聚集成没有生物活性的直径约0.1～3.0μm的固体颗粒——包含体。 形成包含体的基因表达产物的一级结构(即氨基酸序列)虽然正确，而其立体结构是错误的，所以没有生物活性。因此，为获得天然状态的目标产物，必须在分离回收包含体后，溶解包含体（变性），并设法使其中的目标蛋白质恢复应有的天然构象和活性（复性）。 包含体的分离、溶解和复性 细胞破碎效率较重要（溶菌酶处理—高压匀浆）