第三章 DNA的复制课件.pptVIP

第五节 真核基因组的复制 四、核小体的复制 第五节 真核基因组的复制 核小体复制的模式 第五节 真核基因组的复制 五、端粒的复制 1、端粒酶的发现 纤毛虫在有性生殖过程中，大核由小核发育而来，其中小核rRNA基因为单拷贝。 体外切下rRNA基因使它称为游离基因，经过扩增达到一万拷贝，有趣的是：这些经过扩增的rDNA小分子末端都有端粒，也就是具有（G4T2）n重复片段； 但小核rDNA基因的两端原来没有这段重复序列，很明显这些末端重复是在切下后在纤毛虫细胞内加上去的， 如何来证实这一推论呢？ 第五节 真核基因组的复制 1984年，J.shampg等构建了线性质粒，进行了加尾实验 结果表明：端粒复制的模板并不在端粒上 模板在何处呢？ 第五节 真核基因组的复制 2、端粒复制的引物和模板 1985年，Blackburn进行了体外实验寻找端粒复制酶的线索 用四膜虫无细胞核抽提物的体外进行端粒的“加尾”实验，以四膜虫末端重复序列（G4T2）4为引物，以同位素标记dGTP和dTTP为底物进行加尾，结果抽提物可以使引物延伸几百个核苷酸，而且具有重复序列 为什么没有用染色体末端为模板，而延伸的序列又与它相同呢？ 加尾和末端结构到底有什么内在的联系呢？ 这种复制酶是否可以识别呢？ 第五节 真核基因组的复制 加尾和末端结构有核中内在联系呢？ 科学家进行了一系列试验： 以酵母的末端重复序列作为引物时，用四膜虫抽提物加上的仍然是四膜虫的端粒 当以PBR322的片段为引物时，这不能延长末端 当以四膜虫的另一条互补链（C4A2）4为引物时也不能延长 当加热到90度或用蛋白酶处理后，也不能延长末端 第五节 真核基因组的复制 说明： 末端的加尾方向是按富含G链的5-3延伸的，每次以（T2G4）为单位重复 端粒本身不作为模板，而是作为引物合成 酶系统能够识别拟被加尾的末端序列 这种酶具有蛋白质性质，称为端粒酶（端粒转移酶） 端粒酶的特异性是什么呢？ 1990年，Yao M.C等成功地在四膜虫体内诱导了外源DNA序列的加尾，证明特殊染色体的断裂序列有引导端粒酶加尾的作用 同年余国良和Blackburn报道了四膜虫端粒酶可在AT富集区的非端粒序列后加上端粒。成功解释了在小核发育过程中染色体断裂后可以加尾的现象 第五节 真核基因组的复制 3、端粒酶的结构与功能 1987年Greider和Blackbrun分离出端粒酶，其分子量在200-500KD， 进一步分析后发现： 端粒酶是一种含有RNA的蛋白质，RNA长159bp，其中有一段保守序列CAACCCCAA，核酸酶对此区域不能剪切 端粒酶RNA的二级结构 第五节 真核基因组的复制 蛋白质和RNA组成的酶 第五节 真核基因组的复制 采用点突变、缺失和反义技术等进行研究 首先用159bp的不同片段的反义寡核苷酸处理端粒酶，结果发现了翻译序列： 5-GCACTGATTTTGGGGTTG-3 此反义序列可以强烈的抑制端粒酶的加尾活性 因此提出端粒酶RNA中的5 ′ -CAACCCCAA-3 ′此序列是端粒酶的活性部位，并为（T2G4）的末端复制提供模板 第五节 真核基因组的复制 端粒酶RNA的核心序列是端粒DNA复制的模板 1990年，余国良等对四膜虫端粒酶中的RNA基因的核心序列5 ′ -CAACCCCAA-3 ′进行定点突变，再进行转化四膜虫 结果：受体细胞后代的染色体两端出现相应突变的序列，从而有力的证明了端粒酶RNA的核心序列是复制端粒DNA的模板。 同年Remero and Blackburn分析了不同生物的端粒酶，发现不同生物的端粒酶核心序列的碱基数和模板区位置都不同，模板内一些位点的突变不影响功能，但另一些位点突变能引起酶的失活，说明RNA可能有一定的二级结构。 第五节 真核基因组的复制 4、端粒的复制模型 1989年，Greider and Blackburn提出了端粒的复制模型： 首先是端粒酶与端粒DNA结合，端粒酶中的RNA与凸出的3′引物配对 以RNA为模板，在DNA3’端上从头合成DNA延伸6个碱基 合成一个重复单位，端粒酶向DNA模板新和成的3‘移动，引物再和模板配对，进行循环复制。 最后延伸的3’端再回折，以4G体配对的方式形成发夹结构，产生端粒 第五节 真核基因组的复制 第五节 真核基因组的复制 第五节 真核基因组的复制 第五节 真核基因组的复制 端粒复制的重要性 每一次细胞分裂染色体都要从末端丢失核苷酸，端粒的缩短可称为细胞的分裂钟（mitotic clock）。 端粒序列可能被加到染色体的末端，