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分子克隆与外源基因的表达 迟 良 青岛农业大学动物科技学院 分子克隆 概念： 分子克隆：在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法 。 目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 如何获取目的基因？ 1、借助NCBI 没有所需物种基因？ 2、查找文献 3、构建cDNA文库？ 引物设计 引物：与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段 引物设计原则： 1、引物结合序列3’端. 2、.引物长度一般在15~30碱基之间（22~24） 3、引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。（上下游引物GC含量不要相差太大） 4、引物3′端不能选择A，最好选择T ？ 5、碱基要随机分布 6、引物自身及引物之间不应存在互补序列 7、引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物设计好了 送去公司合成 PCR PCR(Polymerase Chain Reaction ):依据DNA半保留复制的原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按照碱基配对的原则经酶促反应合成DNA 片段。 一般PCR反应的成分： 1、双蒸水 2、反应缓冲液（Mg2+） 3、dNTP 4、引物（上游，下游） 5、Taq DAN 聚合酶 6、模板DNA(cDNA）? 反应条件：94°C 5min ，94° 30s，55°30s，72°30s, 72°10min 25-35循环 PCR 之后我们如何确定已经得到了我们所需的目的基因？ 琼脂糖凝胶电泳 测序 目的基因连接T载体？ 基因克隆的质粒载体 概念： 细菌质粒：是存在于细胞质中的一类独立与染色体的自主复制的遗传成分，大部分质粒是由环形双链的DNA 。 载体质粒的特点： 1、载体质粒是一个复制子，由复制起点、复制区和复制终点组成。它能自我复制而不受染色体制约，使它携带的目的基因得到大量扩增 2、可被转化，但不能扩散利于安全，另外相对分子质量小，拷贝数高，便于应用。 3、至少要有两个便于选择的遗传标记。 4、有多个单一的酶切位点，起点在某个遗传标记上，便于克隆，鉴定。 如何将我们目的基因连接到载体？ 限制性内切酶：能够识别双链特定DNA 序列并将DNA 双链切开的酶的总称。 DNA连接酶：能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。 特点： 能够在一条DNA链的3’末端一个游离的羟基（-OH），和另一条链的5’末端游离的磷酸基团（-P）。 需要消耗ATP。 感受态细胞：处于接受外源DNA 的生理状态的细胞。 细胞转化：转化时特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA 导入细菌细胞，并使其生物学特性发生可遗传的变化。 提取质粒 * ？ ？ ？ 1 atgtcgatgc tggcccccct gcgcctgctg cgcgagccct ggaacgccag tgagggcaac 61 cagagcaatg ccacggccgg ggccggaggt gcctggtgcc aggggctgga catccccaat 121 gagctcttcc tgacgctggg gctggtgagc ctggtggaga acctgctggt ggtggccgcc 181 atcctcaaga acaggaatct gcactcgccc acgtactact tcatctgctg cctggccgtc 241 tccgacatgc tggtgagcgt cagcaacctg gccaagacgc tcttcatgct gctgatggag 301 cacggcgtgc tggtgatccg cgccagcatc gtccgccaca tggacaatgt catcgacatg 361 ctcatctgca gctccgtcgt gtcctccctc tccttcctgg gggtcatcgc cgtggaccgc 421 tacatcacca tcttctatgc gctgcgctac cacagcatca tgacgctgca gcgcgccgtg 481 gtcaccatgg ccagcgtctg gctggccagc accg