植物基因工程总结.docVIP

第一章 概述 ?? 植物基因工程的研究范围；相关学科；历史和现状；理论和现实 意义；研究步骤。 第二章 转化系统 ?? 根癌农杆菌Ti质粒转化系统；植物病毒载体系统；植物原生质体转化 系统；植物组织及整体水平的转化系统；转化供体DNA的基本特点； 转化系统的选择；转化选择标记基因；转化体的鉴定。 第三章 目的基因的获得和植物基因启动子的分离 ?? 目的基因的分离克隆；功能蛋白组技术分离目的基因；基因文库技 术分离目的基因；mRNA差别显示技术分离差别表达基因；图位克隆目 的基因；标签法分离克隆目的基因；酵母双杂交系统分离目的基因； 基因芯片技术及生物信息学技术在分离克隆目的基因中的应用。植物 基因启动子的分离克隆。 第四章 外源基因在转基因植物细胞内的表达调控 ?? 转录调控序列对外源基因表达的影响；mRNA 3-端非编码序列对 外源基因表达的影响；5-端内含子的影响；外源基因在转译水平表 达的调控；外源基因转译后的细胞内定位及加工；外源基因的整合、 重排及甲基化；外源DNA整合的遗传效应对基因表达的影响；转基因 沉默的类型及其机理；克服转基因沉默的策略。反义RNA, RNAi, Knock out技术。 第五章 植物基因工程动态 ?? 抗病植物基因工程；抗虫植物基因工程；抗除草剂植物基因工 程；抗逆植物基因工程；品质改良；花形花色控制；雄性不育系的创 建；生物反应器。 绪论 植物基因工程定义(朱桢）：采用工程设计的方式，通过体外DNA重组技术，将特定的外源基因导入受体植物细胞内，由此获得的转化植物可以表现出预期的遗传特性，具有上述特点的科学被称之为植物基因工程。 转化：外源DNA通过载体﹑媒体或其他物理﹑化学方法导入植物细胞并得到整合及表达的过程。实现这一过程的途径称之为“转化系统” 转化系统包括载体系统和受体系统。受体系统的要求：易再生，再生频率高，稳定性、重复性好。 直接把野生型Ti质粒作为载体存在的问题： a. Ti质粒大，不易直接操作。 b.酶切位点太多。 c.T-DNA区内有许多不需要的编码基因。 d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，得到重组质粒，只能在农杆菌中扩增，而农杆菌的接合转化率很低。 e. Ti质粒上有一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。 Ti质粒的改造： 1、除去T-DNA上的生长素（tms）和细胞分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和细胞分裂素会抑制细胞再生为整株植物； 2、除去T-DNA上的冠嘤碱合成基因（tmt）；因为冠嘤碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长； 3、除去TTii 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度； 4、安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作； 5、安装植物细胞的筛选标记，如neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列； 6、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。 先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的Ti质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为“中间载体（intermediate vector），而接受中间载体的Ti质粒则称为受体Ti质粒（acceptor Ti p1asmid），一般是卸甲载体（disarmed vector）。 一元系统中间载体的特征： ①中间载体必须含有与Ti质粒T-DNA区同源的序列，此外含有pBR的序列，在其被引入到根癌农杆菌后即可高频地与Ti质粒的T-DNA的同源序列进行重组； ②它应具有一个或几个细菌选择标记，便于筛选共整合质粒； ③它必须有bom位点，在有诱导质粒存在的情况下，bom位点的存在可以使中间载体在不同细菌细胞内进行转移； ④它应该含有阳性植物选择标记，以利于转化植物细胞的筛选，例如新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase,Npt-Ⅱ)基因，其可赋予转化植物细胞卡那霉素抗性； ⑤它应该含有单一的限制性内切酶切点，以利于外源基因的插入； ⑥无Ti质粒的边界序列。 双元载体（binary vecter）系统是指由两个分别含TDNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统,又因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移,故称之为反式载体（trans vecter）. 一元载体与二元载体系统的比较： 植物基因转化载体必须具备的两个功能。 （1） 媒介，整合 （2）提供被寄主细胞复制，转录系统识别的DNA序列 RNA病毒作为基因载体的基本方法 ①单链病毒RNA反转录成一条单链cDNA（ssDNA）②合成双链cDNA（ds cDNA）③双链cDNA在细菌质粒或