水稻组蛋白抽提-Bio-protocol.PDFVIP

/e1010121 DOI:10.21769/BioProtoc.1010121 水稻组蛋白抽提 陈香嵩，周少立，宗伟，赵毓* 作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：zhaoyu@ 引用格式：陈香嵩，周少立，宗伟，赵毓. (2018). 水稻组蛋白抽提. Bio-101 e1010121. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010121. 实验原理：组蛋白是一类碱性蛋白，且分子量很小，这里介绍的组蛋白抽提方法不能 得到非常纯的组蛋白，只是相对富集分子量较小的碱性蛋白，但是基本能满足一般的 实验要求。 关键词：组蛋白，三氯乙酸，水稻 材料与试剂 1. 1.5 ml 进口离心管 2. 50 ml 离心管 3. 各种型号枪头 (20 μl, 200 μl, 1 ml) 4. Miracloth (Calbiochem, catalog number: 475855) 5. Protease Inhibitor (Roche, catalog number: 11836153001) 6. 水稻样品 7. 液氮 8. 三氯乙酸 (国药集团) 9. 丙酮 (国药集团) 10. EDTA 11. HCl 12. DTT (Sigma, catalog number: D0632) 13. 组蛋白抽提缓冲液 (见溶液配方) 14. 100%三氯乙酸 (见溶液配方) Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010121 DOI:10.21769/BioProtoc.1010121 仪器设备 1. 移液枪 2. 量筒 3. 超净工作台 4. 通风橱 5. 天平 6. 干浴锅 7. 高速冷冻离心机 实验步骤 1. 取50 ml 离心管，加入20 ml 预冷的组蛋白抽提缓冲液，置于冰上待用。 2. 液氮研磨样品，取 2 g 粉末加入到抽提缓冲液中，充分混匀，用单层的 Miracloth (Calbiochem)过滤掉残渣 (视频1)。 视频 1. 样品匀浆后单层Miracloth 过滤 3. 4 度冷冻离心，12,000 x g 离心10 分钟。 4. 取16 ml 上清于另一离心管中，加入4 ml 的100%三氯乙酸 (视频2) 。 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2 /e1010121 DOI:10.21769/BioProtoc.1010121 视频2. 样品上清转移及三氯乙酸沉淀蛋白 5. 混匀后17,000 x g 冷冻离心30 分钟 (转速较高，注意选择进口的离心管)。 6. 弃上清，用1 ml 左右-20 °C 预冷的丙酮洗涤沉淀 (管壁上也有一层乳白色的沉淀， 注意一并洗下，避免丢失) 并转移到1.5 ml 进口离心管中 (视频3) 。 视频3. 丙酮沉淀蛋白 7. 12,000 rpm 冷冻离心10 分钟，弃上清。 8. 重复步骤6、7 两次，每次洗涤时要注意把沉淀彻底打碎，重悬沉淀。 9. 弃上清，置于超净台吹干或通风橱中让丙酮挥发至沉淀如粉状。 10. 加入适量1x Laemmli buffer (一般2 g 样品对应200-300 μl)，室温溶解过夜 (视频 4) 。 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 3 /e1010121 DOI:10.21769/BioProtoc.1010121 视频4. 蛋白溶解 11. 溶解后的样品置于 95 度以上干浴中 10 分钟，离心取 5 μl 左右样品 15% SDS- PAGE 检测，会发现有很多蛋白条带，位于 14-17KD 的位置有几条比较明显的条 带，组蛋白即包含其中 (见图1)。