elmlpa技术的建立及mlpadhplc在染色体非整倍体诊断中的应用分析word格式论文.docxVIP

前言21-三体综合征患者主要表现为智力低下、特殊面容、器官畸形等异常，给家庭和社会造成极大负担。对此类病，至今无有效治疗方法；产前筛查和产前诊断是防止此类患儿出生的有效手段。目前对21-三体综合征高危胎儿的筛查方法主要是唐氏筛查法，即通过测定中孕期母血清中的标记物A-FP（甲胎蛋白）、β-hCG（人绒毛膜促性腺激素）、uE3(游离雌三醇)的水平，结合孕妇年龄、体重及准确的孕周等，计算出胎儿患D.S等的风险率[1]，但其假阳性率很高，且有一定的漏检率。筛查高危时，建议其作羊水细胞染色体核型分析。由于羊水穿刺为有创性检查，对操作者的技术要求高，有导致胎儿流产的可能；羊水细胞培养难度大，周期长（需2周甚至更长），故不易被孕妇所接受。超声测量胎儿颈项后透明带的厚度（NT）作为21-三体综合征胎儿的另一筛查指标[2]，对操作者的经验、技巧及仪器设备等要求均很高，灵敏度低；并且受孕妇体重、糖尿病和吸烟等影响，误差很大。因此研发一种假阳性率低，检出率高的无创伤性产前筛查技术是目前研究的热点。短串联重复序列(STR)是目前最常用的遗传标记，在人类基因组中广泛分布。具有高度多态性、高杂合度、高信息含量、操作简便等特点，多用于人类基因组遗传图谱的制作、肿瘤等疾病相关基因的定位及克隆、遗传性疾病的基因诊断、人类学群体遗传学的应用、法医学的亲子鉴定和个体识别的研究[3]。位于21号染色体上的STR位点基因型在正常人中表现为一条或1:1 的二条带图谱，在21-三体中表现为1:1:1 三体图谱或2:1 双倍剂量图谱，3 条带图谱是诊断三体的金标准，双倍剂量图谱为辅助诊断指标[4]。本研究在21号染色体上D.S 关键区（2lq2.1-21q2.2)或附近选择杂合度高的8 个STR 位点（D21S1446，D21S1437，D21S1432，D21S1413，D21S1414，D21S1270，D21S1411，D21S1412)作为遗传标记，根据STR 所表现出的图谱带特点即可做出诊断。MLPA技术最先于2002年由Schouten[5]等首次报道，有很多优点，现广泛应用于人类基因或基因片段的缺失或重复、染色体三体型、染色体重排、肿瘤等的检测[6]，但它不能直接用于定量检测STR 序列及包含(CAG)n 等三核苷酸重复数目异常增加的等位基因。本研究拟对MLPA 进行改变，即改变MLPA 探针杂交位置的设计方法，并在杂交完成之后增加一个链延伸步骤，同时进行连接，PCR等，称为EL-MLPA（Elongation- MLPA）；使之能定量检测包含STR多态序列的等位基因，建立一种以孕妇外周血为样本、基于对等位基因定量分析的无创产前筛查21-三体综合征高风险胎儿的新技术。资料和方法一、研究对象80 份外周血DNA 标本，其中包括正常人DNA50 份、21-三体综合征患者DNA30 份。21-三体DNA 标本采自2000-2009 年来我院遗传咨询门诊、妇产科门诊及儿科门诊就诊患者，正常人血标本采自来我院就诊的与该疾病无关的个体。所有标本均经细胞遗传学染色体核型分析证实其核型。二、主要仪器和试剂1、ABI-3130XL Genetic Analyzer：美国PE公司；2、WAVENucleicAcidFragmentAnalysisSystem4500仪（DHPLC仪）。3、ABI-2400型PCR仪：美国PE公司；4、-20℃冰箱：三洋公司；5、4℃ 冷藏柜：海尔公司；6、低温高速离心机：德国SIGMR公司；7、台上高速离心机：德国HERO公司；8、QIAampDNABloodMinikits试剂盒（Qiagene公司）；9、TE 缓冲液；10、EL-MLPA所需8对探针的混合物；11、Q92 质量控制片段；12、MLPA buffer；13、SALSA Ligase-65 buffer A；14、SALSA Ligase-65 buffer B；15、SALSA Ligase-65 buffer；16、dH2O；17、dNTPS(2.5nmol)；18、AmpliTaq DNA Polymerase，stoffel Fragment(1U/ul)；19、10×PCR buffer；20、SALSAFAMPCRPrimers；21、SALSA Enzyme dilution buffer；22、SALSA Polymerase；三、DNA提取及核型分析（一）、外周血血浆DNA 的提取。1、将全血离心8000rpm，1min。取上层血清于2ml 离心管中，再将此离心管离心8000rpm，1min。2、取上层血清400ul于2ml离心管中（注意不要吸到管底，管底可能存有少量的血细胞），再向管中加入40ul