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fap来源的hlaa2限制性ctl表位鉴定及其免疫活性研究word格式论文.docx

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fap来源的hlaa2限制性ctl表位鉴定及其免疫活性研究word格式论文

优秀毕业论文 精品参考文献资料 原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是由本人在导师的指导下,独立进行 研究所取得的成果。除文中已经注明的引用内容外,本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体,均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者: 日期: 年 月 日 学位论文使用授权声明 本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品,知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留或向国家有关部 门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅;本人授权郑州 大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学 位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时,第一署名单位仍然为郑 州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者: 日期: 年 月 摘要 摘要 研究背景 肿瘤一直以来都是威胁人类生命的头号杀手,但在近几年来,肿瘤免疫疗 法逐渐应用到临床治疗当中,取得了令人瞩目的成果。而随着生物信息学与免 疫学的不断发展融合,利用肿瘤抗原预测 HLA-A2 限制性的 CD8+CTL 表位,进 而构建多肽疫苗成为大家关注的一大领域。在这方面,如何选择合适的抗原成 为重中之重。目前该领域所选用的抗原大多为肿瘤自身所表达的,而本文选用 表达在肿瘤基质中的特异性抗原成纤维细胞激活蛋白(Fibroblast Activation Protein α,FAP ) 来进行筛选和鉴定。 FAP 表达于肿瘤相关成纤维细胞 (Cancer-associated Fibroblasts,CAF)中,1986 年首次发现,1990 年正式命名为 FAP,属于 II 型丝氨酸蛋白酶家族。FAP 表达于 90%以上的上皮性肿瘤的基质 成纤维细胞的胞膜和胞浆中,而在正常的成纤维细胞中几乎不表达,是一个特 异性非常强的肿瘤诊断和治疗的靶点。其参与了多种肿瘤发生发展过程,如促 进肿瘤原发灶的形成、帮助肿瘤细胞发生侵润和转移,以及近几年发现的具有 抑??肿瘤免疫的作用,引起了人们极大的兴趣。因此本研究选取 FAP 作为靶抗 原进行表位鉴定和免疫原性的研究。 研究目的 本文的研究目的是通过多种生物信息学软件预测,并通过一系列体内外实 验,筛选及鉴定来源于 FAP 的 HLA-A2 限制性的 CD8+CTL 表位,检测其免疫 原性,为以后多肽疫苗构建应用的可行性提供一定的理论研究基础。 研究方法 首先,我们通过在线免疫信息学软件 SYFPEITHI,BIMAS,NetCTL 对 FAP 进行了 HLA-A2 限制性表位预测。Fmoc 固相合成预测出的打分较高的候选表位 肽,反相高效液相色谱法纯化,并对其进行质谱鉴定。纯化出的表位肽首先通 过结合力和稳定性实验进行初步筛选,得到高亲和 HLA-A2 分子且稳定性较好 的表位肽。之后进行体外和体内免疫活性检测,主要是通过 ELISPOT 实验、胞 内因子染色实验检测诱导的特异性 CD8+ CTL 分泌 IFN-γ 的情况,LDH 靶细胞 杀伤实验检测所诱导的特异性 CD8+ CTL 对靶细胞的杀伤作用。然后进行 I HLA-A2.1/Kb 转基因小鼠动物实验。建立免疫模型,制取小鼠脾脏和腿部淋巴结 细胞,体外诱导培养后,通过 ELISPOT 实验、胞内因子染色实验(ICS)以及 LDH 靶细胞杀伤实验,分析各候选表位肽对转基因小鼠 CTL 的诱导激活能力。 同时收取小鼠外周血血清以及脾脏和腿部淋巴结细胞培养基测定其 IFN-γ 含量, 形成较完整实验体系。 研究结果 利用在线预测工具我们初步选定了 8 条表位肽,Fmoc 固相合成,反相高效 液相色谱仪纯化。质谱鉴定分子量正确。进一步的结合力实验表明来源于靶蛋 白的三个表位 P120(Lys- Leu- Trp- Arg- Tyr- Ser- Tyr- Thr- Ala),P265(Phe- Ile- Ile- Asp- Thr- Thr- Tyr- Pro- Ala),P639(Gly- Leu- Phe- Lys- Cys- Gly- Ile- Ala- Val) 能够形成对 HLA-A2 分子的高效亲和及较好稳定性,结合力指数分别为:0.66, 1.13,1.25,稳定性分别为4h,6h,6h。选定其进入后续免疫活性分析实验。 收集 3 例健康 HLA-A2+志愿者外周血,分离单个核细胞,并用以上表位肽进行 诱导形成表位特异性 CTL,之后以荷载相应表位肽的 T2A2 细胞为靶,与 CTL 共孵育,ELISPOT 实验检测分泌 IFN-γ 的 C

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