大肠菌群的测定（DC法）.ppt

大肠菌群的测定 —— DC半固体试管快速法 一、实验目的 熟练的掌握大肠杆菌的测定方法 通过大肠杆菌的测定了解大肠杆菌的特性 熟练掌握MPN检索表的使用方法。 熟悉DC半固体试管快速法的操作过程 熟练掌握操作技术 二、实验原理 大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸、产气（故能使培养基变色、有气泡产生或琼脂崩裂）、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 三、实验器材 小试管 （7支 ）大试管（3支） 量筒（100毫升的1支） 移液管1ml（3支） 5ml（1支） 10ml(1支） 锥形瓶250ml（1个）烧杯250ml(1个） 玻璃棒 均质袋 纱布 线 剪刀 报纸 油皮纸 棉塞 洗耳球 接种针 恒温灭菌箱 恒温水浴锅 培养箱 天平 酒精灯 火柴 精密PH试纸 标签纸 样品：面包 四、药品配置 安氏指示剂的配制：酸性复红0.5g、蒸馏水100ML、氢氧化钠（IN）16ML 制法：将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液数小时后如复红退色不够。可再加1～2毫升氢氧化钠液。 BTB指示剂的配制：溴化麝香草酚蓝指示剂、 溴化麝香草酚蓝 0.1g 、氢氧化钠 16g 制法：将两者在研钵研磨混合，加水稀释至250ml，制成0.04%BTB溶液。 五、实验步骤 （一）清洗包扎 吸管 洗净烘干后的吸管，在口吸的一端用尖头摄子或针塞入少许脱脂棉花，以防止菌体误吸口中，每支吸管用一条宽约4~5厘米，以45°左右的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，吸管的另一端用剩余纸条迭打结，不使散开，标上容量。若干支吸管扎成一束，灭菌后，同样要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽去吸管 试管和三角瓶 试管和三角瓶都要作合适的棉花塞。棉花塞的作用是起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管或三角瓶。棉花塞的制作要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，棉花塞的长度不少于管口直径的二倍，约2/3塞进管口 若干支管用绳子扎在一起，在棉花塞部分外包，油纸或牛皮纸再在纸外用绳扎紧。三角瓶每个单独用油纸包扎棉花塞。 生理盐水 1.成分 Nacl0.9g,蒸馏水100ml 2.制法 一般每种检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包扎后于121度高压灭菌15min。 （三）培养基的制备 1.成分 蛋白胨1.5g 氯化钠0.5g 乳糖1g K2HPO4.3H2O 0.3g 柠檬酸铁铵0.2g 琼脂粉（或琼脂条0.8g）0.7g 安氏指示剂2ml 蒸馏水100ml 2.制法 将以上固体成分加热溶解于水，调整PH7.2，随即加入两组指示剂与10%去氧胆酸钠水溶液，最后煮沸3分钟备用。 3.注意事项 制备DC培养基不需高压灭菌，做好后培养基为绿色，未用完DC琼脂可加热煮沸，待冷后保存于冰箱中继续使用，有效期为一年 3倍DC半固体培养基，其中除蒸馏水用量不变外，其他成分按3倍量加入，制法同上 制备DC培养基，其中10%去氧胆酸钠水溶液要求在校正PH后加入，以免发生胆酸沉淀 （四）检验方法 样品处理 取面包25g，用剪刀剪碎，用100ml水溶解，用均质器打成浆，再用纱布过滤。 接种 吸取原液3个1ml，分别注入3个灭菌的试管内：再吸取1：10、1：100稀释液各3个1ml分别加入灭菌的试管内，每管1ml。 加入培养基与培养 接种1ml样品的试管，注入已溶化并冷至50c左右DC半固体培养基3ml。立即将样品与培养充分混合，待凝固后，36±l℃温箱内，培养24±2小时，取出观察结果。 六、结果判定 1.培养基变橘红色，有气泡产生或琼脂崩裂，记录为“⊕” 2.培养基为橘红色，或有橘红色菌落无气泡和琼脂崩裂现象，记录为“+” 3.培养基为绿色，有黄色菌落无气泡和琼脂崩裂现象，记录为“±” 4.培养基为绿色，记录为“－” 七、 报告结果 1.根据判定结果，记录阳性管数，直接查对MPN检索表，做报告。 2.如遇“结果判定”中“2”、“3”反应结果，可挑2~3个可疑大肠菌落接种乳糖复发酵管，置37℃温箱18~24h，根据产酸产气管数查对MPN表，做报告。 乳糖发酵管 　 成分 　　蛋白胨　　　　　　　　　　20g 　　乳糖　　　　　　　　　　　10g 　　0