11.3.24年实验一差异分离mRNA.ppt

综合性实验模块（动物发育生物学实验） 综合型实验模块I  （动物发育生物学实验） 实验目的 本实验材料以斑马鱼为主，并阔展到两栖类和哺乳类 一、观察斑马鱼卵母细胞和早期胚胎发育过程中 　　不同时期形态、细胞、组织、器官形成的特点； 二、分离斑马鱼受精卵与神经胚特异基因表达 基因片段； 三、检测胚胎发育过程中的蛋白质表达。 　从形态结构、细胞、组织、分子四个水平上 综合了解动物胚胎发育过程及分子机制。 实验内容 主要材料（斑马鱼、泥鳅和小鼠） 精子 生殖细胞发生过程 受精过程 受精卵 早期发育过程 个体 卵子 第一部分 第二部分 第三部分 第一部分 （生殖细胞发生过程 ） 利用冰冻切片，组织学染色、 显微观察、比较哺乳动物和鱼 的生殖细胞发生过程中组织学 特点。 第二部分 （受精过程） 方法：人工催情、授精。 使学生能掌握鱼的人工授精和 小鼠超数排卵技术。 第三部分 （早期发育过程） 1、通过多媒体演示，跟踪胚胎发育的活体观察 ，了解鱼胚胎发 育过程中不同时期的外形变化的特点。 2、通过多媒体演示，动物胚胎发育模型，采用石蜡切片 技术，了解鱼和蛙胚胎发育过程中不同时期组织发生 变化的特点。 3、采用差异显示技术，分离斑马鱼受精卵与原肠胚差异 基因表达的片段；克隆发育过程中特异表达基因 4、采用石蜡切片和蛋白质原位杂交技术，检测肌动蛋白 质在胚胎发育过程中的表达。 实验一 差异显示法检测斑马鱼卵巢和肝脏特异表达的基因片段 一、实验原理 二、提取RNA 1、每人称取50 mg卵巢或肝脏放入匀浆器中. 加入1 ml 反应液，彻底匀浆至清亮后，移入1.5 ml的EP管中， 冰上静置5 min； 2、加入200 ml的氯仿，颠倒混匀，冰上静置5 min， 12000 rpm高速离心10 min； 3、小心将上层水相移至1.5ml EP管中，加入0.5体积 （200 ml）酸性酚和0.5体积（200 ml）氯仿，颠倒混 匀，冰上静置5 min，12000 rpm离心10 min； 4、小心将上层水相移至1.5 ml EP管中，加入200 ml 氯仿，颠倒混匀，冰上静置5 min，12000 rpm 离心10分钟； 5、小心将上层水相移至1.5 ml EP管中，加入500 ml 异丙醇，颠倒混匀，冰上静置5 min，12000 rpm　 离心10 min，小心弃上清； 6、加入1 ml 75%乙醇漂洗沉淀，高速离心12000 rpm， 5 min，小心弃上清，室温静置干燥15 min； 7、加24.5 ml DEPC处理的水溶解RNA，同时加入 　 0.5 ml RNAsin（50 u/ml）防止RNA降解； 8、取3 ml RNA（加1 ml溴酚兰）用1%琼脂糖胶电泳 鉴定RNA的质量，是否有染色体DNA污染。 *** 结果找老师登记（记成绩） 三、RNA逆转录为cDNA (25ml) 1、取5 mlRNA，加入1 ml Oligo dT16GC (100 mM)(RT 专 用)，混合后，70 ℃变性5 min，迅速置于冰上2 min； 2、分别加入如下试剂： DEPC水 11.5 ml 5×M－MLV Reaction Buffer 5 ml 50 U/ml RNAsin (Ribonuclease Inhibitor) 0.5 ml 10 mM dNTP 1 ml 200 U/ml M－MLV