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雄性花鼠免疫不育的防治研究 　　花鼠 Tamias sibiricus 属啮齿目松鼠科小型半树栖种，在我国东北、华北、陕西北部以及秦岭地区广泛分布（邹波等，1997） .花鼠通常取食树木和经济作物的种子以及各种坚果和浆果，对经济作物和林木造成严重破坏。花鼠不仅吃掉作物，而且会贮存大量作物种子，最多可达作物产量的 75% 以上，造成严重的经济损失（祁勐等，2009） .传统防治花鼠的方法包括笼捕法和毒饵法（周淑荣，2009） ,尽管在一定程度上可以达到控制花鼠数量和保护林木植物的目的，但普遍面临着工作量大、灭鼠效率低、效果差、专一性差、花鼠种群恢复快等问题。因此，寻求一种安全、高效、持久且专一性强的防治措施便成为了急需解决的问题（Córdoba et al. ,2006） . 　　不育控制的概念最早由 Knipling（1959） 提出，并在 20 世纪 90 年代初，免疫不育技术已涉及到了控制有害生物领域。不育技术通过控制雄性或雌性个体绝育或干扰胚胎着床发育，以降低生育率来控制种群数量。目前，有关免疫不育技术的研究已经成为不育控制鼠害的重点，免疫不育是指利用基因重组等分子生物学技术制造使有害生物产生不育的疫苗。21 世纪以来，重组病毒性不育疫苗已经接近实用化（张知彬，2000） ,其研究探索的主要方向是依靠携带不育疫苗的病毒在害鼠种群中传播，使不育疫苗在害鼠体内产生免疫反应，破坏生殖系统，导致害鼠不育（刘汉武等，2011） .由于抗原通常是自身蛋白类或核酸物质，具有特异性结合、对环境无污染、对非靶标动物安全等特点（张浩等，2013） .免疫机制一旦形成，终身具有免疫作用，因此目前在免疫不育研究方面的一个重要热点是，以精子表面抗原制备疫苗，诱导产生精子抗体并产生不育效果（孙美玉等，2009） . 　　乳酸脱氢酶 C（lactate dehydrogenase,LDH-C） 是一类四聚体寡聚酶，位于糖酵解途径的末端，能特异性地催化丙酮酸和乳酸之间的氧化还原反应。在哺乳动物中，LDH 存在 3 种类型的同工酶亚基： LDH-A、LDH-B 和 LDH-C.LDH-C 是组织特异的同工酶，哺乳动物中 LDH-C 基因只在成熟的睾丸组织中表达，且在成熟精子细胞里只存在 LDH-C4 一种形式（Burgos et al. ,1995） .已有研究表明，缺失 LDH-C 基因的雄性小鼠生育能力会严重降低 （Odet etal. ,2008） ,这也说明了 LDH-C4 是设计节育药物的一个很好的靶蛋白。事实上，已有试验以 LDH-C 为抗原制备抗体，并发现可以有效降低哺乳动物的生育能力（Wei et al. ,2001） . 　　我国的免疫不育疫苗研究还处于探索阶段，目前大多以雌性动物卵透明带为研究对象设计不育药物，其效果进展有限，对于雄性不育技术，尤其是花鼠的研究更是空白。因此，本试验针对雄性花鼠进行免疫不育的防治研究，通过克隆花鼠 LDH-C 基因编码区序列，对其翻译的氨基酸序列进行初步分析预测，并进行原核表达的初步探究，以期为蛋白研究和针对花鼠的不育鼠药研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料 　　供试动物： 花鼠捕于陕西省西安市周至县，8 周龄左右。将花鼠饲养在实验室普通大号鸟笼，置于通风良好的安静房间，每只 20 cm 左右长度的花鼠每 2 天喂 1 块蛋糕，每 3 天换 1 次清水，放 1 个苹果，每周清理 1 次排泄物。 　　试剂： RNA 提取试剂盒、ES Taq MasterMix、DNAMarker、核酸上样缓冲液、抗 His 单克隆抗体、羊抗鼠IgG-Biotin 均购自北京康为世纪生物科技有限公司；琼脂糖购自美国 HyraGene 公司； 反转录试剂盒购自立陶宛 Fermentas 公司； PCR 试剂盒购自东洋纺生物科技有限公司； 高效琼脂糖 DNA 凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京） 有限公司； pMD19-T 载体、IPTG、X-gal 均购自日本 TaKaRa 公司； 氨苄青霉素购自北京索莱宝科技有限公司； 酵母提取物和蛋白胨购自英国 OXOID 公司； 感受态细胞 DH5α 和蛋白质Marker 购自北京全式金生物科技有限公司； 牛血清蛋白购自瑞士 Roche 公司； Tween -20 购自德国 Sigma-Aldrich 公 司； HRP-Sterptavidin 结 合 物 购 自 美 国ZYMED 公司； 其它试剂均为国产分析纯。 　　仪器： 9700 型 PCR 仪，美国应用生物系统公司； 5424R 高速冷冻离心机，德国艾本德股份公司；Gel Doc XR + 凝胶成像系统，美国 Bio RAD 公司；NANOPAC-300 型电泳仪，英国 Cleaver Scientific