第二章 第四节 聚合酶链式反应及应用 基因克隆课件方案策划.pptVIP

选择引物PCR扩增 CTCGTAGACTGCGTACATGCAGNNNN…NNNNCTGCA  CATCTGACGCATGT ACGTCNNNN…NNNNG Ps1---GACTGCGTACATGCAGACC Ps2---GACTGCGTACATGCAGCTG 凝胶检测 引物的组成 （1）核心碱基序列，该序列与人工接头互补 （2）限制性内切酶识别序列 （3）引物3’端选择碱基 两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增 AFLP Technology AFLP technology is based on the selective amplification of genomic restriction fragment using PCR. DNA is digested with restriction endonucleases, and double-stranded DNA adapters are ligated to the ends of the DNA fragments to generate template DNA for amplification. Thus, the sequence of the adapers and the adjacent restriction site serve as primer binding sites for subsequent amplification of the restricton fragments by PCR. Selective nucleotides extending into the restriction fragments are added to the 3’ ends of the PCR primers such that only restriction fragments in which the nucleotide flanking the restriction site match the selective nucleotide will be amplified. The amplified fragments are then analyzed by gel electrophoresis to generate the fingerprint. 此项技术与RFLP和RAPD技术相比有许多优点 （1）稳定，重复性好； （2）需用的DNA量少，适用于分析的DNA大小范围宽； （3）能产生更多的多态性标志，得到的条带也更密集，一般比RFLP和RAPD多10～100倍，便于比较分析； （4）操作易于标准化和自动化，适于大批量的样品分析. 第八节 基因工程的其它酶类 第四节 聚合酶链式反应及应用 一、锚定PCR 锚定PCR（anchored PCR）是PCR技术的一种改进，一般的PCR实验中需要知道目的基因两端的序列，而锚定PCR技术不需要。 所谓的“锚定”就是指一端已经定死了，另一端待定（即通过人工合成引物来定），这就为许多我们对不清楚其5’端区域或是3’端区域的RNA的分析找到了一条良好的途径。 1）已知序列3’端区域的扩增 2）已知序列5’端区域的扩增 二、不对称PCR （asymmetric PCR） 三、反向PCR（inverse PCR） 第五节 RAPD技术(Random Amplified Polymorphic DNA) 一、多态性（polymorphism) 1、多态性/差异性的概念 在一个基因座位上有多条等位基因的现象称作遗传多态性（genetic polymorphism）。当多条等位基因在一个种群中稳定存在时，这些等位基因所在的位置被认为是多态性的。如果某条等位基因在种群中存在的概率大于1%，那么就可以认为它是多态的。 2、多态性的种类： 顺序多态性(sequence polymorphisms) 片段长度多态性（length polymorphisms) 3、多态性产生的过程 1）细胞分裂间期 2）减数分裂前期 3）减数分裂中期 4）受精过程 4、多态性的相关技术 RAPD :1990年，William等人第一次运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段作为分子标记并命名为RAPD AP-PCR