南京大学分子生物学实验课讲义.doc

分子生物学实验讲义 第一讲 实验室纪律、实验室安全及分子生物学基本操作所有必修及选修该实验课的学生必须按时进入实验室并按分组名单就座，不得擅自调整组号，有特殊原因不能来上课者须提供书面请假条及相关证明。 上课期间须关闭手机铃声，不得使用任何音乐播放器，禁止讨论与实验课无关的话题，禁止阅读与实验课无关的读物。 严格按照正确的操作使用仪器，用后须关闭电源，不要用手直接触摸有害试剂，废弃物品须丢在指定位置。 保持实验台面整洁，如有污染，须及时清理，实验室地面卫生由值日学生在实验结束后统一打扫。 分子生物学实验每个组常用器材包括一套取液器（20 μl、200 μl及1000 μl共三把）、取液器吸头以及离心管。 20 μl取液器的量程为1 μl ～ 20 μl，200 μl取液器量程为20 μl ～ 200 μl，1000 μl取液器量程为200 μl ～ 1000 μl，20 μl取液器和200 μl取液器配黄色吸头，1000 μl取液器配蓝色吸头。 吸取液体前，首先要选择合适的取液器（例如吸取400 μl液体就应该选择1000 μl取液器），然后将取液器调至所需刻度，插好吸头，按下取液器顶端按钮，将吸头尖端伸至液面下1～2 mm处，缓慢松开按钮，最后把所吸液体打入离心管或其它容器（打的时候可稍快）。 离心管最好在使用之前做上记号，以免不同样品之间产生混淆，离心管在离心机中必须平衡放置，并且离心管把要向外以便确定可能产生沉淀的位置。 第二讲 柱离心法小量提取质粒DNA 实验原理： 质粒是细菌中独立于染色体之外的较小的环状双链DNA，它通常携带某种药物（如氨苄青霉素，卡那霉素，链霉素，四环素等）的抗性基因，具有独立的复制原点，并且具有较高的拷贝数（从几个到几百个不等）。柱离心法首先用碱使大肠杆菌裂解，并使其中的DNA（包括质粒及细菌的染色体DNA）全部变性，再用酸性缓冲液中和，质粒DNA由于分子较小，很快复性，而染色体DNA分子巨大，几乎不能复性，最后和细胞碎片及膜蛋白共沉淀被离心去除，上清液中含有复性的质粒DNA，蛋白质，RNA，并且盐浓度较高，在这种条件下，质粒DNA能够牢固地结合在离心柱中的吸附基质上，而大多数蛋白质和RNA在离心时被穿过，残留在吸附基质上的少量蛋白质和RNA可以用漂洗液洗去，最后，吸附在离心柱上的质粒DNA用低离子强度的溶液或水洗脱。 实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5αLB+Amp培养基（配方参照《分子克隆》，除非特别说明，以下同），柱离心质粒小量制备试剂盒（博大泰克公司） 实验方法： 1．将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5 ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时; 2．1.5 ml过夜菌转移至Eppendorf管中，10000 rpm( r/min)离心1 min，上清液，加入100 (l 溶液I(含RNaseA)，充分混匀; 3．加入150 (l 溶液II，加盖颠倒6-7次使之混匀，室温放置12min; 4．加入150 ( l 溶液III，加盖后颠倒6-7次混匀，室温放置5min; 5．用台式高速离心机，12000 r离心10min; 6．吸附柱中加入420 μl 结合缓冲液，将步骤5中的上清转移至吸附柱中，盖上收集管的盖子，混匀， 12000 r离心1 min； 7．取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600 μl 漂洗液 , 静置1 min，12000 r离心30 s； 8．重复步骤7一次； 9．取下吸附柱，倒掉收集管中的液体，吸附柱放回同一收集管， 12000 r离心2 min； 10．吸附柱放入一个新的1.5 ml离心管，在吸附柱的中央加50 μl洗脱缓冲液或 TE buffer或水，室温放置35分钟。盖好盖子12000 rpm 离心1分钟，收集质粒DNA溶液，-20℃冻存备用。 第三讲 DNA的琼脂糖电泳及限制性酶切 实验原理： 与蛋白质相比，DNA的分子量通常要大得多，必须用孔径较大的琼脂糖凝胶介质进行分离，在理想的电泳条件下，具有相同构型的DNA的电泳迁移率和它们分子量的对数成线性关系，分子量相同的质粒DNA的电泳迁移率和它们的构型有关，由快到慢通常为超螺旋，线性，开环和复制中间体（连环体）。DNA限制性内切酶可以切割环状DNA，II型DNA限制性内切酶具有固定的识别位点和切割位点，它们可以在特定位点以特定方式切割质粒DNA，并且产生有固定序列及形状的末端因此它们在重组DNA技术中具有重要作用。 实验材料： 质粒DNA（pUC18-G），电泳用琼脂糖，TAE缓冲液，goldview荧光染料，6× DNA上样buffer，限制性内切酶EcoRI （10 U/μl，G’AATTC），HindIII （10 U/μl，A’AGCTT），10× bu