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内分泌与代谢病学专业优秀论文 间充质干细胞输注诱导小型猪胰岛移植免疫耐受的研究 关键词：糖尿病 胰岛移植 间充质干细胞 免疫耐受 联合输注法 摘要：胰岛移植重建胰岛素分泌系统，是一种有望彻底根治糖尿病的治疗方法。2000年，Edmonton方案的成功，标志着胰岛移植取得了突破性的进展，从而带动了胰岛移植临床试验性治疗在世界范围内广泛展开。然而移植排斥反应和免疫抑制剂长期乃至终身应用所带来的副作用和潜在危险性如增加感染、肿瘤的发生等仍难以克服。目前普遍认为，解决异体移植排斥反应的关键在于诱导受体对供体的细胞、组织或器官产生免疫耐受。由于移植免疫耐受的机制十分复杂，尽管诱导免疫耐受的方法众多，但均未能达到完全可靠持久的特异性耐受。骨髓细胞输注诱导稳定的混合嵌合状态能够维持长期的器官移植免疫耐受，在啮齿类动物主要通过中枢删除机制来实现。然而，传统的骨髓细胞输注虽能在短期内达到混合嵌合状态，但很快由于嵌合率的急剧下降而使免疫耐受状态难以维持。近年来许多研究在骨髓细胞输注的基础上，对受体进行多次特异性输血或供体淋巴细胞输注，以达到稳定的混合嵌合状态，然而这样会增加移植物抗宿主病（graft versus host disease GVHD）的风险，同时对受体进行的非特异性预处理也会带来许多的临床风险，限制了通过骨髓细胞嵌合体来达到器官移植耐受的临床应用。 间充质干细胞（mesenchymal stem cells MSCs）是存在于成人组织的多能干细胞，可以从成熟的骨髓、脂肪组织、胎盘、头皮和多种胎儿组织中获得，具有向骨组织、软骨和脂肪等的多能分化的潜能。体外实验还发现MSCs在特定的条件下可以向肝细胞、内皮细胞、神经组织和胰岛素阳性细胞等分化。MSCs在心肌损伤的修复，骨代谢紊乱和多种代谢性疾病中显示出很好的疗效。除了以上的组织修复和再生功能外，最近还发现MSCs还具有逃脱免疫识别和抑制免疫反应的特性。Itakura等同时把供体胰岛细胞和MSCs植入大鼠的门静脉，可以观察到胰岛移植物存活期延长的同时GVHD的发生率也降低。本实验室的研究也发现，对小鼠进行抗CD154预处理后，联合输注MSCs和骨髓细胞比单纯骨髓细胞输注能维持更长时间的混合嵌合状态，使胰岛移植物存活时间延长。虽然MSCs已成功的应用于骨髓移植过程中发生GVHD的治疗，但其在同种实体器官移植方面的研究还鲜见报道。 因此，本研究在传统的骨髓细胞输注诱导胰岛移植免疫耐受的同时，对受体进行MSCs输注，以期找到一种更有效、更安全的诱导胰岛移植免疫耐受的方法。由于MSCs容易从骨髓分离和扩增，同时具有逃脱免疫识别和抑制免疫反应的特性，所以在前期小动物实验的基础上，进一步探讨其在诱导大动物（小型猪）胰岛移植免疫耐受中的作用。 目的： 建立小型猪MSCs培养、扩增及胰岛分离纯化的方法，初步探讨MSCs联合骨髓细胞输注诱导同种异体小型猪胰岛移植免疫耐受，观察胰岛移植物存活时间及血清胰岛素的变化，为寻找诱导胰岛移植免疫耐受的新方法提供实验依据。 方法： 1、MSCs分离培养、扩增无菌条件下用含肝素注射器抽取动物骨髓20mL，离心弃上清，将细胞轻缓加入预先配好ficoll-paque分离液的离心管中，1500r/min，离心30min，小心吸取中间交界面的单核细胞层，PBS液洗涤两次，加入L-DMEM培养基，调整细胞数为1×106/mL，置于37℃，5％CO2饱和湿度的孵育箱中培养，48h后换液去除未贴壁的细胞，此后每3～4天换液一次，依据贴壁培养法分离和扩增MSCs，取第五代细胞作为移植供源，调整细胞数1×10/mL。 2、供体骨髓细胞制备无菌条件下抽取动物骨髓约40mL1000r/min，离心10min，弃上清，收集细胞加入红细胞裂解液去除红细胞，1000r/min，离心10min，用Hankamp;#39;s液洗涤两次，加入RPMI1640培养基培养，调整细胞为1×106/mL，台盼蓝染色记数检测活细胞率。 3.糖尿病小型猪模型的建立和胰岛移植动物空腹12h，麻醉后将生理盐水新鲜配制的5％四氧嘧啶（200mg/kg）耳缘静脉注射，将连续两次以上空腹血糖≥7.0mmol/L的动物判定患了糖尿病。无菌条件下将胰岛细胞1×105IEQ、骨髓细胞1×1010和/或MSCs1×108混匀，经肝门静脉输入糖尿病小型猪体内，移植后监测血糖、胰岛素等的变化，连续两次血糖大于11.1mmol/L，以第一次时间为排斥反应的时间。 4.小型猪胰岛细胞的分离纯化放血处死动物后摘取胰腺，胰管灌注胶原酶V，经自制的半自动胰腺消化装置消化分离小型猪胰腺，胰腺消化物用自制的推进式离心管结合HCA-Ficoll单一密度梯度液（1.096/mL）纯化，双硫腙（DTZ）对胰岛进行特异